黄连不同方法提取物治疗2型糖尿病大鼠的比较研究*

童凤雪 张砾丹 邹 欣 魏世超 胡茹楠 刘 谦 陆付耳 徐丽君△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所，武汉 4300302华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 4300303华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合系，武汉 430030

2型糖尿病归属于中医学“消渴”范畴，而黄连用于治疗消渴已有2千余年历史。丸剂是指药材细粉或药材提取物加适宜的黏合辅料制成的球形或类球形制剂，古人应用黄连治疗消渴多以粉末形式如丸剂入药。东晋《肘后备急方》中单用黄连作蜜丸治消渴症，宋代《神效方》中用酒蒸黄连丸治消渴之多饮、多尿、口渴易饥、发热、瘦弱。课题组前期研究[1]表明，黄连粉末直接给药较其相同剂量煎剂具有更好更稳定的降糖效果。为了进一步探究黄连粉末对2型糖尿病的治疗效果，本研究分别采用超临界萃取法和模拟胃液提取法提取黄连粉末，检测其主要有效物质组成，探讨其降糖作用与其主要成分含量的相关性及相关治疗机理。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

90只SPF级健康纯种雄性Wistar大鼠，体重(200±10)g，购自维通利华有限公司。

1.2 实验仪器

崩解仪(24CB10C，美国)，超声临界萃取仪(HA-221-40-11-C型，中国)，粉粹机(24CB10C，美国WARING公司)，高效液相色谱仪(1410 UV检测器，日本HITACHI)，恒温水浴锅(Y14-VFP，英国)，制冰机(日本SANYO公司)，倒置显微镜(日本OLYPUS公司)，酶标仪(09110056，美国Bio-Tek公司)，迷你离心机(LX-200，中国其林贝尔仪器)，漩涡混合器(XW-80A，中国沪西仪器)，恒温箱(XMTD-8222，中国天康电子)，台式高速离心机型(2-16K，德国的sigma公司)，血糖仪(Accu-ChekPerfoma，德国Roche公司)，电子天平(BT25S，中国赛多利斯)，微量加样器(P1000、P200、P100、P20、P2.5，德国Eppendorf公司)。

1.3 实验试剂及药品

黄连由华中科技大学同济医学院附属同济医院中药房提供，经湖北中医药大学生药教研室鉴定本品为毛茛科植物黄连RhizomaCoptidischinensisFranch的干燥根茎。阿魏酸、药根碱、小檗碱、黄连碱、黄柏酮对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98%；巴马丁对照品，购自大连美仑生物科技公司，纯度≥95%。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

盐酸二甲双胍片(国药准字H20023371)购自中美上海施贵宝制药有限公司。罗氏血糖试纸购自德国Roche公司。大鼠血清白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫分析试剂盒购自上海邦亦生物科技公司。石蜡切片购自武汉谷歌生物公司。

1.4 药物制备

1.4.1 黄连粉末制备 取黄连105℃干燥2 h，放入粉碎机中粉碎成过40～60目筛粉末，置于干燥器中备用。

1.4.2 模拟胃液制备 人工胃液配置方法为2 g NaCl、3.2 g胃蛋白酶溶于500 mL纯净水中，加入 7 mL 36.5%浓盐酸，摇匀后，加纯净水定容至1 000 mL。

1.4.3 黄连超临界萃取物 前期运用了正交试验法，对黄连超临界萃取的4个因素及对应的3个水平按L9(34)进行分组设计，根据前期实验结果制定出优化萃取方案：上述黄连粉末200 g，CO230 L/h，萃取时间2 h，萃取分离温度50℃，萃取压力200 MPa，夹带剂为90%乙醇300 mL。依据上述方法萃取黄连超临界萃取物，置于旋转蒸发器(69℃)中浓缩，制成粉末，备用。

1.4.4 黄连模拟胃液提取物 取上述黄连粉末200 g，分2次加入1 000 mL模拟胃液中，置于崩解仪中，温度控制在(37±0.5)℃，第1次搅拌2 h，过滤，收集滤液，滤渣于前述条件下搅拌0.5 h，合并滤液。提取液置于旋转蒸发器(69℃)中浓缩，制成粉末，备用。

1.4.5 黄连提取物指纹图谱的建立及其代表性有效成分的含量测定 运用高效液相色谱法，对黄连超临界萃取物(A)和模拟胃液提取物(B)进行指纹图谱的建立和有效成分的定量研究。

色谱条件为1410 UV检测器，XTerra C18色谱柱(4.6 cm×250 cm，0.5 um)，流动相比例为20 mmol/L KH2PO4(含0.2% H3PO4)：CH3CN-H2O(含25 mmol/L SPB)=62：38，检测波长345 nm，流速0.8 mL/min，柱温36℃。

1.5 造模方法

90只大鼠，经过1周的适应性喂养后，随机选出15只大鼠作为正常对照组(N组)，标准鼠饲料喂养，自由进食和饮水。其余大鼠以高脂饲料(67.5%的标准鼠饲料+12%猪油+2%胆固醇+0.5%胆汁盐+20%糖)喂养40 d后，将大鼠按24 mg/kg体重剂量尾静脉注射小剂量链脲佐菌素(STZ)。以N组大鼠OGTT不同时间点血糖值的95%置信区间作为参照，若高脂饲料喂养大鼠在任意时间点的血糖均高于该置信区间上限的20%，则选择该大鼠作为2型糖尿病大鼠的成功模型。

1.6 分组及给药

制模成功后将糖尿病大鼠随机分为模型对照组(M组)、阳性对照组(D组)、黄连超临界萃取物治疗组(A组)和黄连模拟胃液提取物治疗组(B组)共4组，每组各15只。

D组大鼠予以盐酸二甲双胍片184 mg/(kg·d)灌胃；A组大鼠予以黄连超临界萃取物88 mg/(kg·d)灌胃，B组大鼠予以黄连模拟胃液提取物333 mg/(kg·d)灌胃。所有药物都溶解在1：1的油-水混合物中，每只大鼠的每日灌胃量为1 mL/100 g，胃灌注剂量每周根据大鼠的体重调整；所有小鼠均连续灌胃治疗9周。

1.7 检测指标

1.7.1 OGTT血糖水平检测 连续灌胃治疗9周后，对各组大鼠进行OGTT血糖检测。检测前一晚所有大鼠禁食8 h，第2 d清晨检测空腹血糖(FBG)后，每只大鼠按2.5 g/kg体重剂量灌服50%葡萄糖液，尾静脉取血，测量各组小鼠餐后1 h血糖(1 h PG)、餐后2 h血糖(2 hPG)水平。

1.7.2 体重、血清TG及IL-6水平检测 连续灌胃治疗9周后，各组大鼠称体重(g)，按300 mg/kg体重剂量腹腔注射100 g/L水合氯醛进行麻醉，行腹主静脉采血，分装、分离，收集血清，备用。用试剂盒测定血清TG水平。采用ELISA法检测各组大鼠血清IL-6水平，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算大鼠血清样品中IL-6的含量。

1.7.3 肠道组织病理改变 各组大鼠经上述处理，进行麻醉、采血后，取各组大鼠肠道组织，用冰0.9%氯化钠溶液进行冲洗，滤纸擦干多余水分后置于液氮中保存。将各组大鼠小肠组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中，室温固定24 h以上，常规脱水、浸蜡、包埋后切片。对制好的石蜡切片进行苏木素-伊红(HE)染色，在光镜下观察各组大鼠小肠病理改变情况并拍摄照片。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 相同剂量下代表性有效成分的含量

根据指纹图谱结果，对其中6个峰进行了指认，分别为阿魏酸、药根碱、黄连碱、巴马丁、黄柏酮和小檗碱；通过每组测量4次，取平均值得出2种提取物相同剂量下各代表性有效成分的含量，黄连超临界萃取物均高于黄连模拟胃液提取物。见表1。

2.2 有效剂量下代表性有效成分的含量

根据本课题组前期研究结果显示，黄连超临界萃取物的大鼠有效剂量为88 mg/(kg·d)，黄连模拟胃液提取物的大鼠有效剂量为333 mg/(kg·d)，结合表1结果计算出2种提取物有效剂量下代表性有效成分的含量，黄连超临界萃取物中仅小檗碱与巴马丁的含量高于黄连模拟胃液提取物。见表2。

2.3 OGTT血糖水平比较

造模后，M组大鼠FBG、1 hPG、2 hPG血糖水平均明显高于N组大鼠(P<0.05)；治疗后，D组、A组、B组大鼠FBG、1 hPG、2 hPG水平均明显低于M组大鼠(P<0.05)；A组与B组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 体重、血清TG及IL-6水平比较

造模后，M组大鼠体重、血清TG及IL-6水平均明显高于N组大鼠(P<0.05)；治疗后，D组、A组、B组大鼠体重、血清TG及IL-6水平均明显低于M组大鼠(P<0.05)；A组与B组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5 肠道组织病理改变比较

光镜下，N组大鼠小肠组织基膜连续性完好，细胞结构正常，绒毛完整，其中杯状细胞、炎性细胞及空泡较少；M组大鼠小肠组织基膜连续性较N组明显缺失，绒毛有断裂，杯状细胞、炎性细胞及空泡较N组明显增加；D组、A组、B组大鼠小肠组织基膜连续性可，缺失程度较M组显著改善，杯状细胞、炎性细胞及空泡数量显著减少。见图1。

表1 2种提取物相同剂量下代表性有效成分的含量(n=4，mg/g)

表2 黄连不同方法提取物的大鼠有效剂量中各代表成分的含量(n=4，mg/g)

表3 各组大鼠OGTT血糖水平比较

与N组比较，*P<0.05；与M组比较，△P<0.05

表4 各组大鼠体重、血清TG及IL-6水平比较

与N组比较，*P<0.05；与M组比较，△P<0.05

图1 各组大鼠肠道组织石蜡切片HE染色图片(×400)

3 讨论

黄连是迄今临床上治疗糖尿病最常用的中药之一，其有效成分如小檗碱、黄连碱、药根碱等均具有一定的降糖调脂功效[2-3]。古方中，黄连多以粉末入丸剂来治疗糖尿病，本课题组前期研究也证实，含等剂量小檗碱的黄连粉末和黄连煎剂用以治疗糖尿病，黄连粉末的疗效更稳定、起效时间更快。如何高效提取黄连中的有效成分成为了一个重要问题。

本研究特设计无水提取方法——超临界萃取，其特点完全不同于我们传统意义上的水煎和有机溶剂提取，其萃取液即超临界流体，似液体的密度且介电常数同极性有机溶剂，对化合物的溶剂化能力增强；似气体的传递性质和零表面张力，可进入到任何大于超临界流体分子的空间[4]，如CO2；夹带剂的合理运用可以有效提高中药中有效成分的提取效率[5]，例如乙醇显示出超凡的溶解物质能力，使得被提取物质的性质范围更广。超临界萃取条件接近室温(35～40℃)，有效防止了热敏性物质的氧化和逸散；CO2为惰性介质，萃取过程中不发生化学反应，杜绝了黄连中生物碱和阿魏酸在进行水煎煮过程中的酸碱中和反应，可以最大限度地保证目标效应物质不被破坏、中和或沉淀。为了描述黄连以粉末灌服条件下，其有效成分在胃液中的溶出特征，本研究特采用崩解仪提取模拟胃液，并进行指纹图谱分析，分析黄连模拟胃液提取物中代表性有效成分的含量及比例，为黄连降糖调脂功能的进一步研究奠定基础，并以此提取物直接灌胃，代替粉末口服给药。

越来越多的研究[6]表明2型糖尿病作为一种自然免疫和慢性亚临床炎症疾病，有多种炎症因子参与其中，其中包括IL-6。2型糖尿病患者的血清IL-6水平明显升高，更有研究提出IL-6的异常增高在2型糖尿病的发生发展中起到重要作用。糖尿病患者多有组织慢性炎症改变，已有研究[7]显示糖尿病肠道基膜炎性改变对于疾病发展的重要性更值得关注。

本研究结果显示，2种提取物在相同剂量时，黄连超临界萃取物中各代表性有效成分的含量均高于黄连模拟胃液提取物；2种提取物在有效剂量时，黄连超临界萃取物中仅小檗碱与巴马丁的含量高于黄连模拟胃液提取物；结果表明，在使用同等剂量黄连的情况下，黄连超临界萃取物在经济性方面优于黄连模拟胃液提取物。治疗后，D组、A组、B组大鼠OGTT血糖水平、体重、血清TG及IL-6水平均明显低于M组大鼠；A组与B组比较，差异无统计学意义；D组、A组、B组大鼠肠道组织病理情况较M组大鼠显著改善；结果表明，黄连超临界萃取物及黄连模拟胃液提取物都对2型糖尿病有一定疗效且差异不大。本研究中黄连超临界萃取物和黄连模拟胃液提取物所用剂量是前期研究筛选出的有效剂量，均表现出了良好的降糖调脂效果，其机理可能与炎症相关，主要表现在炎性细胞因子IL-6的表达降低及小肠组织基膜的炎性改变减少。

综上所述，黄连超临界萃取物及黄连模拟胃液提取物均对2型糖尿病大鼠具有一定治疗作用，其主要成分含量与其疗效无相关性，治疗机制可能与改善肠道慢性炎症有一定的关系。黄连超临界萃取物中各代表性有效成分的含量与比例是目前具有降糖调脂作用的一个比较理想的组合，值得更进一步的验证与研究。