酿酒酵母中表达神经肉毒素A及其功能研究

NDIKUBWIMANA Jean de Dieu，邵侃凯，高晓冬，中西秀树

（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122）

基因组测序表明，在真核生物中，囊泡融合机制是高度保守的，SNARE蛋白是膜融合蛋白中的重要成员。SNARE蛋白是保守性很强的蛋白家族，经常被分为 Q-SNARE蛋白和 R-SNARE蛋白[1]。SNARE蛋白位于特定的膜上，只有当Q-SNARE蛋白 R-SNARE蛋白结合时，泡膜才能融合[1-2]。SNARE蛋白最初是从神经元细胞中分离得到，在突触囊泡融合中，syntaxin-1和 SNAP-25扮演 QSNARE角色，synaptobrevin则扮演着R-SNARE角色[1-2]。当囊泡膜上的synaptobrevin与syntaxin-1和SNAP-25结合在一起时，突触囊泡中的神经递质就会释放出来，传递给突触末段。和突触囊泡融合SNARE蛋白同源物类似，在酿酒酵母细胞中，QSNARE蛋白Sso1/2和Sec9与R-SNARE蛋白Snc1/2结合在一起，形成一个平行的四螺旋复合体从而导致酵母细胞膜融合的进行[2-3]。

肉毒神经毒素（BotuIinum Neurotoxin，BoNT）是由厌氧梭状肉毒芽胞杆菌属生长过程中分泌的多分子复合物外毒素[4]，肉毒神经毒素根据α-血清中和能力分为A-G7种亚型[5]，绝大部分脊椎动物只要摄入微量即可引起肉毒中毒[6]。肉毒神经毒素是目前已知毒性最强的神经毒素，被美国疾病控制预防中心（CDC）列为A级生物恐怖剂[7]。肉毒神经毒素是AB结构的神经毒素，由轻链（LC，～50 kDa）和重链（HC，～100 kDa）通过二硫键结合在一起组成[8]。轻链由一个锌离子依赖的金属蛋白酶区域组成，它可以降解 SNARE蛋白；肉毒神经毒素类型A，C，E可以降解 SNAP25，类型 B，D，F，G 降解 VAMP-2，另外类型C还可以降解Syntaxin 1a[9-13]。重链由两个区域组成：一个 N 端转运结构域（HCT，～50 kDa）和一个 C 端受体结合区域（HCR，～50 kDa）[14]。 HCR 进一步分为HCRN和HCRC两个更小的区域。HCRN没有功能活性，但可能参与调整HCT最优的帮助轻链进入宿主细胞，而HCRC介导肉毒神经毒素结合到宿主受体[15-16]。Lacy和Stevens解决了肉毒神经毒素A的晶体结构[17]。

BoNT不仅仅是一种神经毒素，它还可以作为一种治疗药物。早在1954年，Brooks发现在极度活跃的肌肉注射少量的BoNT/A会破坏运动神经末梢乙酰胆碱的释放，从而引起短暂的肌肉松弛[18]。这一发现导致了第1次使用BoNT/A作为治疗药物替代传统手术治疗人类斜视[19]。这些开创性的研究后，治疗用BoNT/A扩展到各种各样由于功能失调的胆碱能终端引起的神经障碍，例如痉挛性斜颈、眼睑痉挛、面部瘫痪、肌张力障碍和痉挛状态[20-21]。BoNT/A还用于美容治疗和头痛治疗[22]。

虽然目前有不少关于BoNT/A的研究，但关于BoNT/A抗性药物及其作为药物用于医用治疗并不是十分成熟，而且没有关于酵母肉毒中毒的研究。本研究在酿酒酵母细胞中表达了BoNT/A轻链，在酿酒酵母中来研究BoNT/A轻链的功能及其能否降解Sec9蛋白。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

酿酒酵母出发菌株Saccharomyces cerevisiaeYPH499，BoNT/A 表达用质粒 pRS426-GAL1pr，SEC9表达用质粒pRS414-TEFpr及引物相关信息见表1。SEC9基因由HXS 33和HXS 34引物PCR获得，△Nsec9基因由HXO 573和HXS 34引物PCR获得，BoNT/A基因由HXO 72和HXO 73引物PCR获得，BoNT/AE224Q由 HXS 76和 HXS 77引物PCR获得。

1.2 主要试剂

限制性内切酶、DNA T4连接酶及Ligation Mix连接酶购于 TaKaRa公司 （大连）；KOD-Plus Neo DNA聚合酶购于东洋纺公司（上海）；PCR产物纯化试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒及脱脂奶粉购于上海生工；ClarityTM Western ECL Substrate显色剂、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于碧云天生物技术研究所；Mouse anti-HA一抗、Goat anti-mouse IGg-HRP二抗购于北京全式金生物技术有限公司，v5抗体购于近岸蛋白质科技有限公司 （上海），PVDF膜购于美国伯乐公司。无水甲醇、无水乙醇及异丙醇等其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.3 主要仪器

压力蒸汽灭菌器（立式）购于上海申安器械厂；电泳仪购于北京六一仪器厂；pH计、电子天平购于梅特勒-托利多仪器公司（上海）；无菌操作台、恒温培养箱购于上海三发科学仪器公司；恒温摇瓶柜购于江苏太仓强乐设备厂；PCR仪、移液枪购于德国Eppendorf公司；凝胶成像系统购于美国 Bio-Rad公司；半干电转仪、SDS-PAGE凝胶电泳仪购于美国伯乐公司；紫外分光光度计、ImageQuantTMLAS 400 mini购置于美国GE公司；荧光倒置显微镜购自日本尼康公司。

表1 本研究所用的菌株、质粒和引物Table 1 Lists of strains，plasmids and primers used in this study

1.4 培养基及其他溶液配制

1）YPAD 培养基：酵母抽提物（Yeast Extract）20 g/L，蛋白胨（Peptone）10 g/L，腺嘌呤（Adeline）30 mg/L，琼脂粉（Agar）20 g/L（固体培养基），葡萄糖20 g/L。 2）LB 培养基：胰蛋白胨（Tryptone）10 g/L，酵母抽提物 5 g/L，氯化钠（NaCl）10 g/L，琼脂粉（Agar）20 g/L （固体培养基）；3）YNB 选择培养基：YNB（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）6.7 g/L，缺陷型粉末2 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L（固体培养基）。SG培养基是用半乳糖代替葡萄糖。4）8 mol/L 尿素：480.48 g 尿素，8.766 g NaCl，25 mmol/L（pH 8.0），加去离子水定容至 1 L。 5）TBST溶液：5 mol/L NaCl 30 ml，1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0）10 mL，Tween20 500 uL，加去离子水定容至 1 L。6）5%脱脂牛奶：称取5g脱脂奶粉，用TBST定容至100mL。7）转膜缓冲溶液：称取甘氨酸 14.4 g，Tris·HCl 3.03g，量取无水甲醇200 mL，加去离子水定容至1 L。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞生长分析将质粒pRS426-GALpr，pRS426-GALpr-BoNT/A转化至YPH499细胞中，在SD尿嘧啶缺陷平板上筛选阳性克隆。将阳性转化子在以葡萄糖为碳源的尿嘧啶缺陷培养平板划线培养48 h，分别用牙签挑取不同的转化子在以葡萄糖和半乳糖为碳源的尿嘧啶缺陷平板上划线，在30℃培养3 d，观察细胞的生长情况。

1.5.2 蛋白质提取将不同细胞接种在5 mL以葡萄糖为碳源的SD尿嘧啶培养基中于 30℃培养至OD660=1.0，收集细胞转移至25 mL以葡萄糖为碳源的SD尿嘧啶培养基上于30℃培养至OD660=1.0，收集细胞转移至30 mL以半乳糖为碳源的SD尿嘧啶培养基中，起始OD660=0.2，30℃培养至OD660=0.8～1.0。不同转化子收集相同数量的细胞，用去离子水洗细胞1次，加8 mol/L尿素缓冲溶液和蛋白酶抑制剂PMSF，加玻璃珠震荡破碎细胞，15 000 g，离心10 min取上清即为所提取蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。

1.5.3 蛋白质免疫印迹

1）电泳：取100 μg蛋白样品上样跑电泳，浓缩胶电压 80 V，30 min，分离胶电压 120 V，60 min。 2）转膜：采用半干式转膜方式，电压25 V，电流1.0 A，时间30 min。3）封闭：5% 的脱脂奶粉封闭 1 h。4）孵育抗体：一抗 1∶5 000，室温 1 h；二抗 1∶5 000 室温 1 h。5）显色：ECL显色液A和B混匀，涂于膜上，用ImageQuant LAS4000mini显色。

2 结果与讨论

2.1 BoNT/A抑制酿酒酵母YPH499生长

在人体内，BoNT/A作用于神经元细胞内腔，特异性降解突触体相关蛋白SNAP25抑制神经递质释放从而导致相关疾病，而酵母细胞中存在SNAP25的同源蛋白Sec9。尽管酵母是真核生物，是研究真核生物的模式生物，但是酵母细胞和哺乳动物细胞存在很大的差异，不知能否在酵母中检测到BoNT/A的表达？在酿酒酵母YPH499细胞中表达BoNT/A是否会抑制酵母细胞的生长？如图1所示，在酿酒酵母YPH499细胞中半乳糖诱导培养8 h之后可以检测到表达的BoNT/A，表达BoNT/A会抑制酵母细胞的生长，这种抑制作用可能是因为BoNT/A过表达在酵母细胞中累积对细胞有毒害作用；也可能是因为过表达BoNT/A降解酵母细胞中膜融合所需要的SNARE蛋白或其他生长必需蛋白。

图1 BoNT/A抑制酿酒酵母YPH499生长Fig.1 BoNT/A inhibits the growth of yeast

2.2 BoNT/A活性突变体不抑制酿酒酵母YPH499的生长

为了研究在酵母细胞中BoNT/A的活性位点Glu224突变为Gln后，突变的BoNT/A表达水平稳定性有无影响，对酵母的生长有无影响。如图2所示，当活性位点突变后，突变体BoNT/A表达水平稳定性几乎没有变化，并且不抑制酿酒酵母的生长。与本研究结果类似，Kukreja等研究发现，BoNT/A的催化活性区域HEXXH的Glu224突变成Gln后，BoNT/A的催化活性完全失去[23]，这都说明BoNT/A对酿酒酵母的生长抑制作用是通过其水解酶催化活性来实现的。

图2 BoNT/A活性突变体不抑制酿酒酵母YPH499生长Fig.2 BoNT/A mutant does not inhibit the growth of yeast

2.3 在sec9△中过表达Sec9可以回补酵母的生长

图3 在sec9△中过表达Sec9可以回补酵母的生长Fig.3 Overexpression of Sec9 in sec9△could rescue the yeast growth

由于SEC9是酵母生长必须基因，在YPH499中敲除SEC9基因的酵母不能生长，因此我们在酵母中先导入一个pRS316-SEC9质粒在敲除SEC9基因。如图 3所示，sec9△（pRS316-SEC9）中导入pRS414TEF-SEC9质粒，5-FOA移除pRS316-SEC9质粒后 sec9△（pRS414TEF-SEC9）仍可以生长，这说明pRS414TEF-SEC9质粒可以在酵母中表达并能回补sec9△菌株的生长。

2.4 在酵母中过表达Sec9可以解除BoNT/A对生长的抑制

从图2可知，BoNT/A对酵母细胞的生长抑制作用是基于其水解酶蛋白活性。在动物细胞中SNAP25是BoNT/A的降解底物，而在酵母中只有SNAP25的同源基因SEC9，因此，为了探究Sec9蛋白是否会被BoNT/A降解，本文在酵母中过表达Sec9蛋白，观察是否能回补被BoNT/A抑制的酵母的生长。如图4所示，过表达Sec9可以回补被BoNT/A抑制的酵母的生长。

图4 过表达Sec9可以回补BoNT/A对酿酒酵母YPH499的抑制Fig.4 Overexpression of Sec9 could rescue the inhibition of BoNT/A to YPH499

3 结语

本研究在酿酒酵母细胞中表达了BoNT/A，研究发现，在酿酒酵母细胞中BoNT/A通过其水解酶活性抑制酵母细胞的生长，当活性位点被突变，失去水解酶活性的BoNT/A不会抑制酵母细胞的生长。可以利用酵母细胞研究BoNT/A的功能，同时还可以在酵母细胞中进行BoNT/A抗性药物的筛选。同时研究还发现，在表达BoNT/A的酿酒酵母细胞中过表达Sec9蛋白可以解除BoNT/A对酵母细胞的生长抑制作用。可以推测Sec蛋白可能是BoNT/A在酵母细胞中的识别底物，BoNT/A是通过降解Sec9蛋白从而抑制酵母的生长。本研究为酵母中肉毒神经毒素的研究提供了一定的理论依据，可以通过在酵母中表达肉毒神经毒素，可以对其功能进行进一步研究，可以在酵母中建立肉毒神经毒素筛选系统，还可以探索在酵母中是否存在肉毒神经毒素新的降解底物。