亚硫酸氢钠对酵母GJ2008高质量浓度蔗糖乙醇发酵的影响

杨丽峰， 伍时华， 赵东玲， 张 健， 黄翠姬

（广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006）

甘蔗糖蜜是制糖工业的副产品，主要含有30～60 g/dL 的糖、5～10 g/dL 的胶体和 5～16 g/dL 的灰分等其它物质[1]，以及许多酵母发酵所需的营养成分，已经成为我国南方地区乙醇生产的主要原料[2]。亚硫酸法制糖得到的糖蜜，亚硫酸钠质量浓度为200～700 mg/L，亚硫酸盐是甘蔗糖蜜中影响酵母发酵的抑制物之一[3]。然而亚硫酸盐抑制酵母代谢的机理并不完全清楚，目前研究主要集中在细胞和分子水平上，抑制酵母细胞膜的正常代谢，影响酵母糖酵解过程，与乙醛发生反应，抑制乙醇脱氢酶的活性，诱导胞内活性氧 （reactive oxygen species，ROS）和Ca2+升高，引起酵母死亡[4-7]。针对甘蔗糖蜜乙醇发酵生产存在的乙醇度低、发酵周期长问题，开展亚硫酸盐对酵母细胞乙醇发酵能力影响的研究，这对甘蔗糖蜜高质量浓度乙醇发酵工业生产具有重要的基础研究意义。

为了研究亚硫酸盐对蔗糖乙醇发酵的影响，将NaHSO3贮备液添加到YPS（Yeast Extract Peptone Sucrose)培养基进行乙醇发酵，通过曲线下面积（Area under the curve/AUC）[8]等方法研究发酵过程中NaHSO3对蔗糖、果糖和葡萄糖的代谢、细胞生长及乙醇生成的影响，旨在为实现甘蔗糖蜜高质量浓度乙醇发酵提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株 乙醇酵母 （Saccharomyces cerevisiae）GJ2008为甘蔗汁乙醇发酵的高产菌株，由广西科技大学发酵工程研究所保藏。

1.1.2 培养基 斜面活化培养基 (g/L):酵母浸膏10，葡萄糖 20，蛋白胨 20；自然 pH。

一级种子培养基(g/L):酵母浸膏10，葡萄糖20，蛋白胨20；自然pH。

二级种子培养基(g/L):酵母浸膏10，糖蜜204，蛋白胨20；自然pH。

YPS发酵培养基(g/L):酵母浸膏10，蛋白胨20，蔗糖274；自然pH。

以上培养基均于115℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.1.3 发酵方法 将实验室保藏菌种接至一级种子培养基中，摇床120 r/min，32℃培养12 h后以体积分数10%接种量转接至二级种子培养基中，摇床120 r/min，32℃培养12 h后经4 000 r/min离心10 min，弃上清液得湿酵母泥，加入无菌水振荡混合制得10倍浓缩种子悬液。以体积分数10%接种量（3 mL浓缩种子液）接种至300 mL的YPS发酵培养基中（500 mL三角瓶）进行发酵，NaHSO3贮备液过滤除菌加入发酵液中，调节浓度梯度 （g/L）为0.00、0.16、0.49、1.14、1.63，以 0.00 g/L 为对照试验组。初始酵母数约5.15×107个/mL，用透气膜封口，摇床120 r/min，32℃条件下进行发酵，每组3个平行。发酵开始0、3 h以后每隔6 h取样并测CO2失重，CO2失重小于0.3 g时发酵结束。

1.2 分析方法

样品处理:取4 mL发酵液，12 000 r/min冷冻离心3 min，用移液枪吸取上清液储存于-60℃冰箱，用于糖和乙醇浓度分析；加入与吸取上清液等量无菌的0.85 g/dL生理盐水振荡混合成菌悬液储存于4℃冰箱，用于测定酵母细胞OD值和死亡率。

发酵参数测定:使用SGD-IV全自动还原糖测定仪测定还原糖及酸解后的残总糖。使用UV-1100紫外可见分光光度计，在560 nm波长下统一稀释30倍测量菌悬液的吸光度。采用美兰法[9]测定酵母细胞存活率。采用生物传感分析仪SBA-40C测定葡萄糖和乙醇浓度，标准品的葡萄糖质量浓度1 g/L、乙醇体积分数0.075%，发酵上清液稀释至合适浓度进样分析。蔗糖质量浓度等于残总糖质量浓度减去还原糖质量浓度，果糖质量浓度等于还原糖质量浓度减去葡萄糖质量浓度。

1.3 发酵过程曲线分析

蔗糖、果糖、葡萄糖、残总糖的代谢曲线以及OD值和乙醇度变化曲线运用GraphPad Prism 6.0软件进行绘制，并分别获得蔗糖、果糖、葡萄糖、残总糖、OD值和乙醇度曲线下面积[8]，记作蔗糖AUC、果糖AUC、葡萄糖AUC、残总糖AUC、OD值AUC[10]和乙醇度AUC。

1.4 发酵参数计算

发酵参数按蒋凯描述方法进行计算[11]。

2 结果与讨论

2.1 亚硫酸氢钠对细胞生长的影响

在不同亚硫酸氢钠质量浓度（g/L）0.00、0.16、0.49、1.14、1.63条件下，酵母GJ2008生长趋势基本一致，0～12 h为延滞期和对数生长期，12 h以后达到稳定期，如图1所示。当NaHSO3质量浓度低于1.14 g/L时，酵母经过短暂的适应后开始快速、大量繁殖；当NaHSO3质量浓度为1.63 g/L时，发酵0～3 h，细胞数明显没有增加，3 h后细胞才开始呈对数增长。单位时间OD值AUC（OD值AUC/发酵时间）可以简捷、直观地描述发酵过程中酵母细胞生物量的变化趋势，评估酵母的生长状况[10]。细胞生长状况越好，细胞数目越多，单位时间OD值AUC越大，反之亦然[12]。由表1可知，不同NaHSO3质量浓度梯度下，对照组的单位时间OD值AUC最大（16.69），单位时间OD值AUC随NaHSO3质量浓度的增大而减小，当NaHSO3质量浓度为1.63 g/L时，单位时间OD值AUC最小(14.26)。表明亚硫酸氢钠的加入使酵母细胞生长缓慢，细胞数减少；且亚硫酸氢钠质量浓度越高，细胞总数越少。

图1 不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下乙醇发酵过程细胞生长曲线Fig.1 Profiles of biomass growth during the alcohol fermentation process by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

表1 不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下酵母细胞生长曲线下面积Table 1 Area under the biomass production vs.time growth curves for fermentation by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

图2 不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下乙醇发酵过程细胞死亡率曲线Fig.2 Profiles of the death rate during the fermentation process by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

由图2可知，发酵0～18 h，不同NaHSO3质量浓度梯度的酵母细胞死亡率都较低，当NaHSO3质量浓度低于0.16 g/L时，酵母细胞在18 h以后开始大量死亡；当NaHSO3质量浓度超过0.49 g/L时，24 h以后酵母细胞死亡率出现快速升高的现象。细胞死亡率越小则酵母死亡率AUC越小，细胞死亡率越大则酵母死亡率AUC越大。如表1所示，未添加NaHSO3对照组的酵母细胞死亡率AUC最小（1 484），酵母死亡率AUC随NaHSO3质量浓度的增大而增大，当NaHSO3质量浓度为1.63 g/L时，酵母死亡率AUC最大（2 386）。表明NaHSO3的加入抑制了酵母细胞的生长，使细胞生长迟缓、细胞数减少、细胞活性降低[5]，发酵时间延长。

2.2 亚硫酸氢钠对糖代谢的影响

不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下，初始总糖为274.00 g/L的蔗糖乙醇发酵残总糖拟合曲线见图3。由图3可知，未添加NaHSO3时，酵母细胞耗糖发酵48 h结束；NaHSO3质量浓度越高，糖消耗越慢，发酵时间越长。曲线下面积法能够简单、准确地判断糖的利用情况[8]。残糖量越高则残总糖代谢AUC越大，说明糖消耗越慢；残糖量越低则残总糖代谢AUC越小，说明糖消耗越快[13]。由表2可知，不同NaHSO3质量浓度条件下，蔗糖、葡萄糖和果糖的AUC均随着NaHSO3质量浓度的增大而增大；未添加NaHSO3的残总糖AUC最小 （4 078），残总糖AUC随着NaHSO3质量浓度的增大而增大，当NaHSO3质量浓度为1.63 g/L时，残总糖AUC达到最大（6 609）。表明亚硫酸氢钠的加入抑制了酵母细胞的糖消耗，糖利用抑制程度随亚硫酸氢钠质量浓度的增大而增强。

图3 不同亚硫酸氢钠质量浓度下酵母细胞乙醇发酵残总糖代谢拟合曲线Fig.3 Fitted profiles of sucrose metabolism for alcohol fermentation by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

表2 不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下蔗糖乙醇发酵残总糖曲线下面积Table 2 Area under the sugar metabolism curves for ethanol fermentation by S.cerevisiae GJ2008 at different sodium bisulfite concentrations

总糖消耗速率可以定量地表示单位时间糖消耗的快慢[11]。由图4所示，发酵0～3 h，对照组总糖消耗速率为9.52 g/(L·h)；NaHSO3质量浓度为 0.16 g/L和1.63 g/L时，总糖消耗速率分别降低了36.97%和81.96%。发酵3～6 h，对照组总糖消耗速率达到最大25.65 g/（L·h）， 当 NaHSO3质量浓度为 0.16 g/L 和1.63 g/L时，总糖消耗速率分别下降39.65%和78.09%。发酵6 h后，试验组酵母细胞糖耗变快，原因是由于开始时细胞生长受到NaHSO3抑制，经过延滞期后细胞糖利用速率变快。发酵18 h后，乙醇度不断升高，对酵母细胞有一定的毒害作用，此时细胞生长达到稳定期，总糖消耗速率出现下降的趋势。说明NaHSO3使总糖消耗速率变慢；且NaHSO3质量浓度越高，总糖消耗速率越慢。

图4不同亚硫酸氢钠质量浓度下乙醇发酵过程总糖消耗速率Fig.4 Profiles of total sugar uptake rate during the fermentation process at different sodium bisulfite concentrations

比总糖消耗速率能够准确地表示单位时间内细胞与糖消耗之间的关系[11]。由图5可知，发酵3～6 h，对照组比总糖消耗速率为10.71 g糖/（1 011个活细胞·L·h），当 NaHSO3质量浓度为 0.16 g/L 和 1.63 g/L时，与对照组相比比总糖消耗速率分别下降了30.81%和 43.14%。0～3 h和 3～6 h未添加NaHSO3的对照组比总糖消耗速率远高于试验组的比总糖消耗速率，说明NaHSO3的加入使单位数量的酵母细胞消耗糖的能力降低，发酵周期延长。

图5 不同亚硫酸氢钠质量浓度下乙醇发酵过程比总糖消耗速率Fig.5 Profiles of special total sugar uptake rate during the fermentation processatdifferentsodium bisulfite concentrations

2.3 亚硫酸氢钠对葡萄糖和果糖利用差异性的影响

蔗糖在转化酶的作用下，一分子蔗糖水解为一分子葡萄糖和一分子果糖。葡萄糖与果糖共用一套膜运输和酶催化体系，但由于膜运输和酶亲和力的差异，酵母优先利用葡萄糖，后利用果糖[14-15]。相同初总糖质量浓度条件下，葡萄糖AUC/果糖AUC的值小于1表示酵母优先利用葡萄糖，葡萄糖利用速率比果糖利用速率快。由表3可知，同一NaHSO3质量浓度梯度下，葡萄糖AUC/果糖AUC总是随发酵时间的延长而依次减小。发酵6 h到发酵结束时对照组的葡萄糖AUC/果糖AUC由0.65依次下降至0.32，且葡萄糖AUC/果糖AUC总是小于1，表明酵母优先利用葡萄糖，证实了酵母对葡萄糖的嗜好性[16]。不同NaHSO3质量浓度梯度下，同一发酵时间段葡萄糖AUC/果糖AUC的值随NaHSO3质量浓度的增大而增大。发酵12 h时，对照组的葡萄糖AUC/果糖AUC的值为0.55，当NaHSO3质量浓度为1.63 g/L时，与对照组相比葡萄糖AUC/果糖AUC的值增大了27.27%。表明随着亚硫酸氢钠质量浓度的增大，葡萄糖消耗速率变慢，葡萄糖代谢更易受到亚硫酸氢钠的影响，且抑制程度随亚硫酸氢钠质量浓度的增大而增强。

表3 不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下酵母细胞不同发酵时间点的葡萄糖与果糖代谢面积比值Table 3 Ratio of glucose AUC to fructose AUC during fermentation by S.cerevisiae GJ2008 in YPS media containing different sodium bisulfite concentrations at different fermentation times

2.4 亚硫酸氢钠对乙醇生成的影响

不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下，蔗糖乙醇发酵的乙醇生成曲线见图6。未添加NaHSO3对照组的乙醇度最高达到15.45%（体积分数），随NaHSO3质量浓度的增大，最终乙醇度呈现逐渐下降的趋势。乙醇的生成与细胞数量和糖消耗有密切的关系[11]，比较图4和图7发现总糖消耗速率和乙醇生成速率总体趋势基本一致。发酵3～6 h，对照组酵母细胞处于对数生长期，乙醇生成速率为 8.86 g/(L·h)，当NaHSO3质量浓度为0.16 g/L和1.63 g/L时，与对照组相比乙醇生成速率分别下降了11.51%和70.32%。由图8可知，发酵3～6 h，对照组的比乙醇生成速率为 4.03 g 乙醇/（1011个活细胞·L·h），当 NaHSO3质量浓度为0.16 g/L和1.63 g/L时，与对照组相比比乙醇生成速率分别下降了7.44%和29.28%。结果表明:亚硫酸氢钠质量浓度越高，糖消耗速率越慢，最终酒精度越低，且亚硫酸氢钠的加入使单位数量的酵母细胞生成乙醇的能力降低。

图6 不同亚硫酸氢钠质量浓度下乙醇发酵过程酒精生成曲线Fig.6 Profilesofalcoholproductionduring the fermentation process at different sodium bisulfite concentrations

图7 不同亚硫酸氢钠质量浓度下乙醇发酵过程酒精生成速率Fig.7 Profiles of alcohol production rate during the fermentation process at different sodium bisulfite concentrations

图8 不同亚硫酸氢钠质量浓度下乙醇发酵过程比乙醇生成速率Fig.8 Profiles of special alcohol production rate during the fermentation processatdifferentsodium bisulfite concentrations

表4 不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下酵母GJ2008蔗糖乙醇发酵参数Table 4 Parameters of ethanol fermentation by S.cerevisiae GJ2008 in YPS media at different sodium bisulfite concentrations

2.5 不同亚硫酸氢钠质量浓度条件下乙醇发酵参数比较分析

不同NaHSO3质量浓度条件下，酒精酵母GJ2008蔗糖酒精发酵的主要参数见表4。不同NaHSO3质量浓度梯度下，当NaHSO3质量浓度为0.16 g/L和1.63 g/L，与对照组相比，细胞生长变慢，细胞数减少，耗糖变慢，残总糖分别增大了21.32%和47.37%；发酵周期分别延长了0.00%和37.50%；酒精度分别降低了3.37%和9.19%；乙醇产率分别降低了3.54%和33.86%；总糖发酵效率分别降低了3.39%和9.21%。耗糖发酵效率随NaHSO3质量浓度的增大而降低，但差别不大；试验组酒精度AUC与对照组酒精度AUC的比值随NaHSO3质量浓度的增大而变小。当NaHSO3质量浓度为0.16 g/L和1.63 g/L，与对照组相比试验组乙醇度AUC与对照组乙醇度AUC的比值分别降低了4.94%和27.02%。表明添加亚硫酸氢钠后酵母细胞的生长受到抑制，细胞生长变慢，总糖消耗速率变慢，发酵周期延长，残总糖略高，乙醇度稍低，乙醇产率、总糖发酵效率和耗糖发酵效率降低；且抑制程度随亚硫酸氢钠质量浓度的增大而增强[6，17]。

3 结 语

甘蔗制糖工艺中的亚硫酸法是用石灰和二氧化硫作为澄清剂的蔗汁澄清方法。硫磺燃烧生成二氧化硫，经过硫熏中和除去蔗汁中的胶体、色素等不利于蔗汁澄清的杂质[18]。SO2易溶于水，水溶液中含有分子 SO2（SO2·H20），HSO3-（亚硫酸氢盐），SO32-（亚硫酸盐）。甘蔗制糖的副产物糖蜜中含有少量的亚硫酸盐[3]，亚硫酸盐溶液中存在下面的反应:

其解离常数（pK 值）分别为 pK1=6.91，pK2=1.81[4]。亚硫酸盐溶液中离子或分子的存在形式与溶液的pH有明显的关系。由于酵母的胞内pH约为5.5～6.5，亚硫酸盐主要以HSO3-的形式存在，同时发酵液中还含有微量的游离 SO2分子[4，6]。

由图1和表4可知，当NaHSO3质量浓度为0.16 g/L时，与对照组相比细胞数和发酵效率都有所降低，此结果与Alves[17]研究类似。不同NaHSO3质量浓度条件下，与对照组相比试验组酵母细胞生长受到抑制，糖消耗变慢，单位数量酵母细胞的糖消耗、乙醇生成的能力下降，发酵周期延长。亚硫酸盐以游离 SO2的形式抑制酵母细胞的生长[19-20]。Schimz等[19]研究亚硫酸盐对酵母细胞生长的影响发现:pH低于4.0，Na2SO3的浓度超过1 mmol/L时，酵母细胞生长受到抑制，ATP消耗程度与Na2SO3浓度、温度、pH等有关。Pilkington等[20]研究亚硫酸盐对酵母生长的影响，细胞生长的亚硫酸盐抑制浓度为1.0 mmol/L～2.0 mmol/L，同时伴随着乙醛和甘油产量的增加。亚硫酸盐抑制细胞的生长主要表现在3个方面:①游离SO2分子进入酵母细胞后影响细胞膜的正常功能[6]，与特定的受体结合使细胞膜受到伤害，抑制3'磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）还原酶活性，使NADPH氧化为NADP+受阻[4]，引起胞内pH下降和跨质膜运输动力消耗，使细胞生长受到抑制[5，20]；②游离SO2分子进入酵母细胞后使细胞内代谢产物渗漏[4]；③游离SO2分子激活了细胞内的ATP水解酶系统，使细胞内ATP含量快速下降，细胞代谢所需ATP不足[6，19]，最终导致酵母细胞丧失活性[5]。此外，游离SO2分子进入酵母细胞后影响糖酵解过程，使葡萄糖或果糖转化为丙酮酸受阻；游离SO2分子与乙醛反应，抑制乙醇脱氢酶的活性，致使生成乙醇的能力降低[4]。

本试验研究了以274 g/L蔗糖为底物的高质量浓度乙醇发酵过程中，不同亚硫酸氢钠质量浓度条件对酵母GJ2008细胞生长、糖代谢和乙醇生成等参数的影响。结果表明:亚硫酸氢钠的加入抑制了酵母细胞的活力，使糖消耗速率变慢，乙醇产率降低；与果糖代谢相比葡萄糖代谢更易受到亚硫酸氢钠的影响,且抑制程度随亚硫酸氢钠质量浓度的增大而增强。研究亚硫酸氢钠对蔗糖乙醇发酵的影响，以AUC等指标可以从整体上反应亚硫酸盐对糖代谢、细胞生长及乙醇生成的抑制程度，从而为实现甘蔗糖蜜高浓度乙醇发酵工业生产提供研究基础。