SPME-GC-MS结合组学技术分析发酵椰奶特征风味与风味物质相关性

雷文平 周 辉 周杏荣 吴 坤吴 霓 宋艳菲 刘成国

(1. 湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

椰子(Cocosnuciferal)属棕榈科，是一种单子叶植被，具有较高营养与药用价值，椰汁与椰肉富含蛋白质、脂肪、膳食纤维、维生素、钾、钙、镁等营养物质[1]； 有研究[2-4]表明椰子具有抗菌、预防糖尿病、抗癌等功效。有学者[5-7]研究了椰子相关发酵制品，但仍以牛乳为原料，向其中加入椰浆进行复配发酵；并且椰子制品主要包括椰子油、椰奶、椰子水和椰子肉等；而完全以椰浆作为原料的发酵制品以及利用SPME-GC-MS对其风味成分的分析未见报道；因此，对椰浆发酵制品风味成分鉴定有待进一步研究。

固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术(SPME-GC-MS)被广泛应用于食品风味物质的研究；气相色谱—质谱联用技术对于高挥发性的小分子量与高沸点的大分子量的物质具有较低检出限，并且固相微萃取(SPME)技术允许在短时间内以简单的方式从固体和液体基质中分离挥发性物质[8-10]。目前，部分学者[11-13]利用气相色谱—质谱联用技术主要集中在对发酵制品风味物质的含量及种类等分析，并未将特征感官风味与风味成分结合起来分析相应风味物质贡献的特征感官风味，而利用SPME-GC-MS结合组学技术能较准确分析发酵制品的特征感官风味与风味物质的相关性[14]。

本研究拟以发酵椰奶为主要研究对象，利用固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术对发酵椰奶的风味成分进行分析，结合组学技术从感官和风味物质方面分析了发酵椰奶的特征风味，并以原味椰奶和酸牛奶作对比。旨在为发酵椰奶风味物质组成的鉴定及相关品质的改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

佳乐椰浆：苏门答腊SAMBU集团；

酸牛奶：食品微生物实验室自制，制作方法参考文献[15]；

直投式发酵剂(Directed vat set，DVS)Y428A、Y439B、Y429A：上海昊岳食品科技有限公司；

脱脂奶粉：太子奶集团生物科技有限责任公司；

果胶：食品级，厚满生物科技(上海)有限公司；

海藻酸丙二醇酯：食品级，郑州亿之源化工产品有限公司；

白砂糖：食品级，长沙尚杰食品有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：PUCHUN型，上海精密科学仪器有限公司；

生化培养箱：GZ-400-S型，韶关市广智科技设备有限公司；

双人单面垂直净化工作台：SW-CJ-2D型，苏州博莱尔净化设备有限公司；

超级恒温水浴锅：601型，金坛市医疗器厂；

冷藏柜：SC-320D型，青岛海尔股份有限公司；

气质联用仪：GCMS-QP2010型，岛津企业管理(中国)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵椰奶的制备 首先将椰浆预热至(60±1) ℃，并向椰浆中加入果胶(0.3 g/L)、海藻酸丙二醇酯(0.9 g/L)以及白砂糖(80 g/L)，加水至所需用量，混合搅拌均匀，制备成椰奶；然后将上述椰奶在温度60 ℃、压力25 MPa的条件下进行一级均质处理2～3次；将均质后的椰奶在温度95 ℃条件下杀菌处理25 min；杀菌完成后冷却至(35±2) ℃，在无菌条件下加入30 g/L的直投式发酵剂至椰奶中，并在温度39 ℃的条件下发酵7～8 h，待达到凝固状态，且酸度为55～65 °T时即为发酵终点。最后，将恒温发酵后的产品迅速冷却至10 ℃以下，放入0～4 ℃的冰箱冷藏后熟24 h。

1.3.2 感官特征分析 将制备完成的发酵椰奶，以及原味椰奶(按1.2.1制备而成的椰奶)和酸牛奶，参照GB/T 16291.1—2012的感官评判标准，组建10人的感官评定小组。感官评价所用的描述性感官词，来源于感官分析术语[16]和相关文献[17]词汇。

1.3.3 风味成分分析 将制备完成的发酵椰奶，以及原味椰奶和酸牛奶，利用固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术进行风味成分分析。

1.3.4 感官特征评价方法 分别称取20 g发酵椰奶、原味椰浆和酸牛奶放入3个品尝杯中，对其进行气味、滋味感官评定。每次评定的样品编号采用3位随机数字。评定员品尝完一个样品后用矿泉水漱口，每个样品重复3次。感官评分标准(0～9分)：0分(无)；1～3分(较弱)；4～6分(中等强度)；7～9分(强)。经训练后样品感官风味特征描述词为甜味、酸味、椰子味、奶香味、果香味、乳脂味、香草味、蒸煮味、醇香味、焦糖气味[18]。

1.3.5 风味成分测定方法

(1) 样品萃取方法：称取按1.3.1所制备发酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶样品各1 g，分别置于15 mL萃取瓶，旋紧萃取瓶盖，温度为50 ℃条件下处理30 min, 然后利用老化后的萃取头在温度为70 ℃条件下顶空吸附45 min，最后插入GC-MS进样口解吸1 min，拔出萃取头进行GC-MS分析。

(2) GC条件：DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃；柱箱升温程序：初温35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min升温至200 ℃，再以20 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min；载气为氦气He，流速为1 mL/min；进样采用自动分流方式进行，分流比10∶1[19-20]。

(3) MS条件：EM电离源，离子源温度250 ℃；接口温度200 ℃；检测电压为1 kV；质量扫描范围m/z为35～400[21-22]。

1.5 数据统计

采用Excel 2010软件进行数据分析，显著性水平为P<0.05；利用R Studio软件对样品进行(Principal component analysis，PCA)分析，并以Origin Pro 2018软件作图；采用SIMCA-P 11.5分析软件对发酵椰奶气味感官数据与挥发性风味物质进行偏最小二乘法分析(Partial least squares regression，PLS)。

2 结果与分析

2.1 感官风味特征评定

通过对感官评定人员进行培训后，对发酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的感官风味特征评定，评定的结果见表1。

表1 感官风味特征评定结果†

† 同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表1可知，发酵椰奶感官风味特征在甜味、酸味、椰子味、奶香味、乳脂味以及醇香味感官评分较高，其评分皆>3.00。对于甜味，发酵椰奶感官评分(5.70±0.45)相对于原味椰奶(8.60±0.53)显著降低，原因可能是微生物发酵后产酸，使得发酵椰奶甜酸比发生变化；而相比酸味，酸牛奶(8.20±0.63)比较显著。对于椰子味，椰奶在发酵前后感官评分并无显著变化，表明微生物发酵并未削弱其特有椰子风味。同时，发酵椰奶在其它风味特征上感官评分相比酸牛奶并无显著差异，表明发酵椰奶既保留了椰子特有风味，并且具备酸牛奶特有风味特征。

2.2 感官风味特征主成分分析

利用R Studio软件对发酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的风味感官评分进行主成分分析，其主成分载荷矩阵和PCA图分别见表2及图1。

对发酵椰奶、原味椰奶以及酸牛奶的风味特征感官评分进行主成分分析，前3个主成分特征值的累积贡献率已达74.49%，能够解释原始变量绝大部分信息。由表2 可知，第1主成分(PC1)与甜味、酸味、椰子味以及香草味4个感官风味特征有较大相关性，其载荷绝对值均>3.5，表明PC1可以看作基本感官风味的代表。第2主成分(PC2)与奶香味、果香味和焦糖气味3个感官风味特征有较大正相关，其载荷绝对值均>4.0，表明PC2能够代表风味乳的特有风味。第3主成分(PC3)与奶香味和蒸煮味呈较大负相关，其载荷绝对值均>4.5，表明PC3可以看作不愉快感风味代表。

由图1可知，发酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶在距离上有明显区分；发酵椰奶主要感官风味特征比较丰富，其主要集中了焦糖气味、果香味、奶香味、椰子味和醇香味等感官风味特征；而原味椰奶和酸牛奶感官风味较为单一，且均有不愉悦的感官风味，分别为蒸煮味和酸味；同时，发酵椰奶处在原味椰奶和酸牛奶之间，进一步说明发酵椰奶既有椰子固有风味，也具备酸奶特征风味。

表2 感官风味特征主成分载荷矩阵

2.3 风味成分测定

采用SPME顶空吸附收集，GC-MS法对发酵椰奶、原味椰奶和酸牛奶的挥发性风味成分进行测定，其挥发性风味成分的总离子流图见图2，样品中各类挥发成分的定性和相对定量结果如表3所示。

图1 感官风味特征PCA图Figure 1 Principal component biplot of sensory flavor characteristics

图2 发酵椰奶、原味椰奶与酸牛奶挥发性风味成分总离子流图

Figure 2 Total ion current chromatograms of volatile compounds of fermented coconut milk、natural coconut milk and yogurt

表3 不同样品中挥发性成分†

† “-”表示样品中该风味化合物未检测出。

由表3可知，发酵椰奶的风味成分种类繁多，总共检测出23种挥发性成分，其中酸类10种，醇类3种，酮类3种，醛类2种，酯类4种，其它化合物1种；原味椰奶总共检测出18种挥发性成分，其中酸类7种，醇类2种，酮类2种，醛类1种，酯类6种；酸牛奶中总共检测出21种挥发性成分，其中酸类9种，醇类2种，酮类4种，醛类2种，酯类4种。

酸类物质主要表现在滋味上。己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸等酸类物质相对含量较高，是影响二者滋味的重要风味成分；而相对发酵椰奶而言，丁酸、戊酸、L-乳酸是发酵椰奶的特征酸味物质，丁酸与戊酸使得发酵椰奶表现出奶油香味，L-乳酸是发酵椰奶中的主要呈味酸类，这些特殊酸类物质赋予了发酵椰奶独特的风味[14]。

醇类物质的风味阈值较高，虽然对风味贡献不大，但是醇类可以转化成酸[23]。发酵椰奶中醇类物质的相对含量为6.575%，而原味椰奶和酸牛奶分别含有0.560%和5.135%；发酵椰奶中检测出了14-甲基-8-十六碳烯-1-醇以及(+)-2,3-二氢香叶基香叶醇等醇类成分，而原味椰奶中几乎未检出。丰富的醇类物质使发酵椰奶表现出典型的醇香味。

原味椰奶中酮类物质含量相对较少(1.505%)，而酮类是酸牛奶的重要风味物质之一。具有奶油香味的3-羟基-2-丁酮作为酸奶制品中重要风味成分，这一成分的检测结果差别较大，发酵椰奶中相对含量比原味椰奶和酸牛奶分别高10.295%和7.605%[24]；2,3-戊二酮具有焦糖气味，兼具坚果果香；2-庚酮具有水果气味。酮类物质是由不饱和脂肪酸的氧化、热降解, 氨基酸降解或微生物代谢产生，酮类挥发性化合物一般呈奶油味或果香味[25]。

醛类物质的风味阈值一般较低，是各种氧化风味的来源[26]。发酵椰奶中醛类物质的相对含量为2.270%，原味椰奶和酸牛奶中醛类物质相对含量分别为0.325%和2.025%；壬醛具有类似蜡香、蜂蜜香风味[26]，使得发酵椰奶风味更加醇和。

酯类物质是一种很重要的风味物质，椰子脂肪是酯类物质的主要来源，主要是通过脂肪酸水解和微生物代谢产生[27]。发酵椰奶和原味椰奶的酯类物质相对含量都比较高，分别为29.850%和40.520%；相比原味椰奶，发酵椰奶中酯类物质含量明显降低，这使得发酵椰奶滋味更加清淡柔和。

由表3还可知，含硫化合物在风味物质中很重要，风味阈值比较低，发酵椰奶中检出1种含硫化合物，而原味椰奶和酸牛奶中并无检出。

2.4 发酵椰奶感官气风味特征与风味物质的相关性分析

利用SIMCA-P 11.5分析软件对发酵椰奶风味感官数据与挥发性风味物质进行偏最小二乘法分析(PLS)，其PLS分析图见图3。

图3 发酵椰奶感官气味特征与挥发性风味物质的PLS 分析图

Figure 3 Linear partial least-squares regressionanalysibiplot of flavor zttributes and volatile flavor compounds of fermented coconut

由图3可知，图中包括2个变量，分别为感官风味特征和挥发性风味物质，二者的距离越相近，表明其相关性越好，解释性越强[28]。图中2,3-戊二酮、3-羟基-2-丁酮和2-壬酮等风味物质主要贡献了果香味、奶香味和焦糖气味，与陈娟等[26]描述较为一致；14-甲基-8-十六碳烯-1-醇和(+)-2,3-二氢香叶基香叶醇主要贡献在醇香味上，且表3中二者相对含量也相对较高，进一步表明醇香味主要由这2种物质贡献；酸味主要由丁酸、己酸等各种脂肪酸贡献；癸酸乙酯、δ-葵内酯、丁位壬内酯、月桂酸乙酯等酯类主要贡献了香草味、甜味、椰子味和蒸煮味。综上所述，酮类物质主要贡献给发酵椰奶奶香味，酸味主要由脂肪酸贡献；椰奶在发酵过程中产生了不佳风味如蒸煮味等，其与酯类化合物有密切关系。

3 结论

利用组学技术从感官和风味物质方面分析了发酵椰奶的特征风味，并与原味椰奶和酸牛奶进行对比。通过主成分分析表明发酵椰奶主要集中在甜味、酸味、椰子味、奶香味、乳脂味以及醇香味等感官风味特征，其感官评分均>3；而相比原味椰奶，其感官风味显著得到改善，尤其消除了原味椰奶的蒸煮味。同时，发酵处理对原味椰浆风味成分影响显著，从发酵椰奶中共检测出23种风味成分，比原味椰奶和酸牛奶分别多5种和2种，相比原味椰奶，发酵椰奶中酸类和酯类成分显著下降，而醇类、酮类和醛类成分明显上升。进一步结合感官风味特征进行PLS分析发现发酵椰奶中2,3-戊二酮、3-羟基-2-丁酮和2-壬酮等风味物质与果香味、奶香味和焦糖气味相关性较强，而蒸煮味主要由酯类物质贡献，也说明通过发酵降低了酯类物质成分，能改善原味椰浆的蒸煮味。本研究利用SPME-GC-MS结合组学技术分析发酵椰奶的特征感官风味与风味物质相关性，而在研究风味物质的形成机理以及相关感官风味与风味物质联系机制方面有待进一步研究。