“芯片肺”的研究进展

王松 白义春 马雅娜 刘聪 郭冰心 吉宏龙新乡医学院肺病与分子治疗研究所453003;德克萨斯大学泰勒医学研究中心细胞与分子生物学系,泰勒75708

呼吸系统疾病是严重危害人类健康的常见病、多发病。空气污染、吸烟以及人口老龄化等多种因素使呼吸系统疾病的流行病学和疾病谱分布正在发生改变。由于缺乏高效特异的药物治疗,肺移植是目前治疗终末期呼吸系统疾病较为可靠的方法,但该方法却受到供体缺乏以及免疫排斥反应等因素的限制[1]。所以,我们亟需一个高通量药物筛选模型,进行更有效的药物研发和筛选,这对发现新的精准治疗措施至关重要。“芯片肺”是一种在微流控芯片上利用微加工技术制造出的仿生肺三维模型。它可以模拟肺脏气血屏障的部分功能、肺部炎症和肺水肿的发生过程,用于评估空气中纳米颗粒的吸收,以及评价新药的安全性和有效性。此外,通过细胞共培养技术还可建立非小细胞肺癌模型,对肺癌的发生过程进行研究。本文将从 “芯片肺”的结构、研究进展等方面进行介绍。

1 “芯片肺”的结构及其作用原理

1.1 “芯片肺”的结构 哈佛大学维斯生物工程研究院的研究人员首次研制出可以模拟肺泡功能的 “芯片肺” (图1),这种 “芯片肺”能够精确的模拟人肺不同组织间的相互作用,在肺泡水平上重现肺的部分生理功能[2]。 “芯片肺”分为上下两层,上层为气体通道,模拟肺泡腔;下层为液体通道,模拟血管腔,中间由多孔的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)薄膜 (10μm)将其分隔。在PDMS 薄膜的上、下表面均包被一层细胞外基质(extracellular matrix,ECM),上表面培养暴露在空气中的人体肺泡上皮细胞,下表面培养浸润在液体中的血管内皮细胞,在体外模拟人肺泡气血屏障的主要结构、功能和力学性质。细胞在接种到附有ECM 的PDMS薄膜对立面后,分别在各自的通道中形成紧密连接的单层细胞。之后,气体通道中通入空气,模拟在体状态下肺泡上皮细胞生存的气-液界面,液体通道中通入液体,模拟在体状态下血管内皮细胞生存的液体环境。气体进入气体通道后,肺泡上皮细胞分泌表面活性物质增多,形成气-液界面,增强了肺泡稳定性;当液体通道通入液体后,血管内皮细胞被重新排列。在 “芯片肺”的左右两侧存在两个侧室与两个真空泵相连,通过规律地改变侧室的压力,引起PDMS薄膜规律的起伏,进而模拟肺的呼吸运动[3]。目前 “芯片肺”已成功地在体外模拟了肺气血屏障的多项基本功能。

图1 “芯片肺”结构示意图[2]

1.2 “芯片肺”的作用原理 肺泡是肺的基本功能单位。平静呼吸时,吸气运动膈肌与肋间外肌收缩,胸廓扩大,外界大气压力高于肺内气压,外界空气流入肺泡,肺泡随之扩大,使肺泡上皮细胞和肺泡毛细血管内皮细胞伸展;呼气运动膈肌和肋间外肌松弛,胸腔容积缩小,肺弹性回缩,肺内压也随之升高,当高于大气压时,肺内气体排出肺泡,使肺泡上皮细胞和肺泡毛细血管内皮细胞回缩。“芯片肺”通过与两个侧室相连的真空泵的规律作用,引起两个侧室内压力的变化,进而引起PDMS 薄膜形变。与PDMS薄膜紧密相连的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞也随之发生伸展和回缩,以此来模拟肺呼吸运动时产生的机械应力[3]。不同的是,肺呼吸运动时,肺泡与外界大气之间的压力差为肺通气提供了直接动力,“芯片肺”模型中真空泵的规律变化引起的压力差仅通过引起PDMS薄膜的弹性形变来模拟肺泡在肺通气过程中的起伏,并不能模拟呼吸肌运动提供的原动力。另外,“芯片肺”还不能实现人肺肺泡与血流之间的换气功能。

呼吸道与外界相通,全身血液均流经肺脏,故肺脏易遭受身体内外微生物的侵袭。因此,肺脏除了主管呼吸功能外还具备非呼吸性的防御与免疫功能。“芯片肺”模型除了可以模拟呼吸运动外,还能模拟肺脏免疫功能。通过在“芯片肺”的气体通道和液体通道中分别加入炎症因子和免疫细胞,模拟体内肺炎等呼吸疾病发生时的免疫过程。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激肺泡毛细血管内皮细胞使细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达增强,促进了中性粒细胞的黏附。中性粒细胞黏附于血管内皮细胞扁平化,由血管内皮细胞间隙渗出,通过PDMS薄膜出现在肺泡上皮细胞。在 “芯片肺”中加入免疫细胞,可以实时监控循环的免疫细胞在疾病发展中的作用[4-5]。除循环的免疫细胞外,肺部驻留的免疫细胞在肺部疾病发展中也起着重要作用[6],不足的是,“芯片肺”无法模拟驻留的免疫细胞在肺部疾病发展中的具体作用。

2 “芯片肺”与细胞模型和动物模型的差别

2.1 “芯片肺”与细胞模型的差别 通常新药的药效及毒性测试实验在细胞模型及动物模型中进行,单一细胞的静态培养是组织病理学、药效学和药代动力学最常用的细胞模型。但其无法模拟各种肺细胞间的相互作用和呼吸运动。另外,呼吸运动产生的机械力和血流产生的剪切力对肺细胞的生长、修复、损伤、炎症、表面活性物质的释放以及组织的发育有着强烈的影响[7],所以单一细胞的静态培养无法准确的模拟体内细胞生长和药物代谢真实环境[8-10]。“芯片肺”能够模拟呼吸运动产生的机械力和血流产生的剪切力,使细胞的生长、分化的力学条件更接近人体。在“芯片肺”的气-液界面培养的肺泡上皮细胞与静态细胞培养相比增大了通过细胞层的电阻和屏障功能,表现出与肺相似的蛋白通过率[3,11]。

2.2 “芯片肺”与动物模型的差别 动物实验,尤其是啮齿类动物已经在生理学和病理生理学方面做出了极大的贡献,并且能够反映完整个体中的药物代谢情况。但耗时长、价格昂贵,动物模型与人类在呼吸系统生长发育、结构功能、细胞比例和疾病的特征等方面不尽相同[12-13],导致药物研发多在临床试验阶段失败。此外,动物模型存在一系列的伦理问题[9-10,14-15]。综上所述,动物模型已经无法满足更为精确的实验需求。“芯片肺”能够模拟肺的主要功能、肺在体内生长分化所需微环境以及肺和所处微环境之间的相互作用[16]。每一种具体的 “芯片肺”模型都能通过人为主观地改变某种条件,使其更接近肺在体或疾病发展的相应状态,并且能够研究该变化在疾病发展和治疗过程中的作用。因此,“芯片肺”或在肺部疾病的防治方面发挥重要作用。

3 “芯片肺”在呼吸疾病研究中的应用

3.1 “芯片肺”在肺炎中的研究 肺炎是指由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物所致的终末气道,肺泡和肺间质的炎症。细菌感染是引起肺炎的主要因素之一,研究表明,当将大肠杆菌加入 “芯片肺”的气体通道后,ICAM-1表达明显增强,血管内皮细胞对中性粒细胞的黏附作用增强。随后,中性粒细胞激活、迁移、渗出,最终到达肺泡上皮表面,并吞噬大肠杆菌。此外,研究人员在 “芯片肺”模型气体通道中加入TNF-α以及IL-8等炎症因子,中性粒细胞出现了与在气体通道中加入细菌相同的结果。该结果与临床上肺炎时中性粒细胞的迁移一致,证明 “芯片肺”模型能够重现人体内病原微生物以及炎症因子等引起的肺炎发生以及免疫应答过程[3,17]。

大量研究表明吸入纳米颗粒可引起肺炎[18-20]。将直径12 nm 的二氧化硅纳米颗粒加入 “芯片肺”的气体通道,纳米颗粒通过激活肺上皮细胞产生促炎因子,同时活化血管内皮细胞表达ICMA-1从而引起肺炎,这与临床试验相符。运用 “芯片肺”模型同时发现,机械牵张在此过程中起着非常重要的作用。活性氧 (reactive oxygen species,ROS)是调节炎症反应的重要信号分子,研究人员以ROS的产生量为指标,定量测定机械牵张对吸入纳米颗粒引起肺炎的影响。结果显示,仅用纳米颗粒而无机械牵张作用时,“芯片肺”产生很少或不产生ROS。而在有机械牵张时,相同条件下的纳米颗粒则能引起ROS的稳定增长。进一步研究表明,ROS的产生量与机械牵张强度成正比,而且长期受到二氧化硅纳米颗粒的作用时,即使没有机械牵张的参与,仍然会产生大量的ROS[3,16-17]。在 “芯片肺”上的研究结果表明,机械牵张能显著增强由纳米材料导致的肺炎发生,这种效应在小鼠模型上已经得到验证[3]。

3.2 “芯片肺”在肺水肿中的研究 肺水肿可能是由于多种疾病或限制剂量的药物毒性引起的毛细血管静水压或微血管通透性增加所致[21]。研究人员向 “芯片肺”的血管通道中加入IL-2,观察到大量培养液从液体通道中渗漏,直至气体通道完全充满积液。临床上使用IL-2进行治疗恶性黑色素瘤或转移性肾细胞癌时的确能够引起肺水肿[22],说明 “芯片肺”能在体外模拟肺水肿的发生[2]。

研究人员利用 “芯片肺”模型进行实验发现,呼吸运动产生机械牵张能够放大IL-2 引起血管通透性增高的效应。仅用IL-2处理内皮细胞而无机械牵张作用时,肺毛细血管屏障功能受损不严重,当有机械牵张作用时,等剂量的IL-2会引起肺毛细血管屏障功能严重受损[21,23]。在 “芯片肺”上进一步实验发现,机械牵张通过激活瞬时感受器电位离子通道4 (transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)增大了细胞间隙,导致毛细血管通透性增加和肺血管渗漏,从而放大了IL-2 引起血管通透性增高的效应[24]。

有数据表明TRPV4通道阻滞剂能够抑制机械牵张引起的效应,研究人员在 “芯片肺”模型上利用TRPV4 通道阻滞剂 (GSK2198374) 验证了这一推断。使用GSK2198374完全抑制了IL-2与机械牵张引起肺水肿的效应,该实验结果与心力衰竭致肺水肿动物模型实验结果相吻合。除GSK2198374 外,血管紧张素1 (angiotensin 1,Ang-1)与IL-2联合使用加入 “芯片肺”的血管通道时,也能有效的抑制内皮细胞的渗漏。由此可见,“芯片肺”模型不仅可以模拟临床上肺水肿的发生,而且可以用于筛选预防和治疗肺水肿的药物,这为临床预防和治疗肺水肿提供了可靠的依据[21,23]。

3.3 “芯片肺”在非小细胞肺癌中的研究 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌约占肺癌的80%,严重危害人类健康[25]。研究人员在 “芯片肺”技术的基础上采用细胞共培养技术建立了非小细胞肺癌模型。结果发现,呼吸运动产生的机械牵张并没有促进癌细胞的生长,反而抑制了癌细胞的生长。该结果表明呼吸运动减弱可能会促进肺癌的进展。Hassell等[26]发现原机械牵张作用明显降低表皮生长因子 (epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达,而大大增强了EGFR Y845、Y998 和Y1068几个位点的磷酸化,导致相同的抗癌药物在传统细胞模型较 “芯片肺”模型敏感性更高。有数据表明,细胞间质上皮转化因子 (cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-MET)蛋白的过表达与多种癌症的发生以及对癌症晚期患者产生抗药性有关。在药物敏感性降低的非小细胞肺癌 “芯片肺”模型上c-MET 也出现了过表达现象,二者相吻合[27-29]。

3.4 “芯片肺”在气道疾病中的研究 Benam 等[30]在“芯片肺”技术的基础上利用小气道上皮细胞建立正常小气道模型,并成功的模拟小气道的多项生理功能。使用IL-13处理该模型模拟哮喘的发作,观察到哮喘发作的典型特征,如杯状细胞增生,黏液分泌增多,粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)产生和分泌增强,气道纤毛摆动频率降低[31]。使用高剂量的托法替尼处理哮喘模型,观察到上述现象消失或减轻,与药物临床应用效果相符。此外,使用病毒复制时产生的双链RNA 类似物聚胞苷酸[polycytidine acid,poly(I:C)]处理该模型成功模拟了病毒感染引起的哮喘急性发作[5]。

另外,Benam 等[32]利用COPD 患者小气道上皮细胞建立COPD 模型,并观察到COPD 患者的多项特征。他们使用细菌的细胞壁成分脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)和poly(I:C)处理正常小气道模型和COPD 模型,发现仅使用poly(I:C)处理COPD 的模型时,才会出现巨噬细胞集落刺激因子 (macrophage colony stimulatory factor,M-CSF)的大量分泌。所以,M-CSF 可以作为病毒引起的COPD 急性加重的特异性标志物[5,32]。利用气道上皮细胞建立的气道模型检验电子香烟对肺组织产生的影响,结果表明,电子香烟气溶胶能产生与香烟类似的影响[33]。

3.5 “芯片肺”在肺血栓栓塞中的研究 Jain 等[34]在“芯片肺”的基础上利用原代肺泡上皮细胞建立肺泡模型,该模型用于研究肺血栓栓塞及其药物的研究。结果发现,LPS直接活化血管内皮细胞不会引起血小板聚集以及血栓形成,而是通过活化肺泡上皮细胞间接引起血栓形成。parmodulin-2 (PM2)是一种潜在的蛋白酶激活受体-1 抑制剂,具有抗炎抗凝作用。使用PM2 提前处理该模型,30 min后再用LPS 处理,发现血小板聚集的现象明显降低,说明该模型能有效地评估抗血栓药物的效果。

4 小结与展望

“芯片肺”可部分代替动物实验在体外进行研究,能够较准确地模拟肺的在体状态,对于呼吸系统疾病的病变特征及机制研究有着重要作用;“芯片肺”可有效的评估新药的作用效果,对于呼吸系统疾病和药物的研究具有重要意义。此外,“芯片肺”呼吸运动的动力变化可以通过主观控制,能够观测和研究各种疾病发展过程中呼吸运动带来的影响,这在静态细胞培养模型和动物模型上是无法进行的。然而 “芯片肺”的发展还处于起步阶段,存在许多不足。例如,真实的气血屏障由液体层、肺泡上皮细胞层、上皮基膜层、基质层、毛细血管基膜层和内皮细胞层构成,比“芯片肺”复杂。在模拟肺水肿的 “芯片肺”模型中使用的肺上皮细胞,是从肺癌患者中分离出来的,因此 “芯片肺”不可能完全模拟人体肺泡上皮屏障功能[17,21]。此外,PDMS的机械强度较差,在体外模型的尺寸上限制了 “芯片肺”的开发与应用;而且PDMS薄膜还会影响到疏水物质的吸收,所以在物质吸收方面也不能完全与肺相同[35-38]。肺在体内并非单一独立的器官,而是与其他系统相互关联的,因此 “芯片肺”虽然能够在一定程度上模拟肺的生理功能,但是仅限于肺泡水平,而不能模拟肺脏的整体功能以及肺脏与个体的相互作用与联系,因此未来的研究重点将会转向人工智能控制的多个器官联系的 “多器官芯片”模型甚至 “人体芯片”模型[39-41],从而使我们的研究更加精确的模拟完整个体。

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