普洱熟茶主要成分检测和分离的研究进展与展望

黄业伟 ， 朱强强 ， 向泽敏 *， 张冬英 *

（1.普洱茶学教育部重点实验室，云南昆明 650201；2.云南农业大学理学院，云南昆明 650201；3.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）

普洱茶是云南的特有名茶，是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定加工工艺制成的，具有独特品质特征的茶叶[1]。普洱熟茶的特殊加工工艺决定了其独特的品质特征和健康功效。近年来，随着普洱熟茶保健功效被逐渐揭示，越发引起人们对普洱熟茶功能成分及其作用机理的关注。但由于普洱熟茶加工过程中特殊的湿热作用和微生物作用，导致其成分分析和分离一直是该领域的热点和难点，这也在一定程度上阻碍了普洱熟茶保健功效机理的阐明。检测分析普洱熟茶成分的方法很多，前人也已做了很多研究工作。文章通过对现有的文献进行综合分析，总结普洱熟茶成分分析和分离方面的研究成果和现存问题并寻求可能的解决办法。

1 普洱熟茶主要成分的检测现状

普洱熟茶发酵过程中，其原料化学成分发生了很大程度的转化，如多糖、蛋白质等的降解和多酚类物质的氧化等。因此，普洱熟茶发酵阶段色泽的量化分析，即多酚氧化程度可作为普洱熟茶品质评价的重要指标[2]。普洱熟茶主要成分的分析包括茶多酚、儿茶素、咖啡碱、没食子酸、茶多糖、茶褐素、茶红素、茶黄素、水溶性蛋白质、总黄酮和游离氨基酸等。其中单体成分的测定主要采用高效液相色谱法，检测方法和结果相对可靠。其它主要成分的分析方法包括：蒽酮比色法和硫酸苯酚法测定茶多糖含量；香荚兰素-浓盐酸比色法测定总儿茶素；Bradford法测定蛋白质含量；比色系统分析法测定茶黄素、茶红素和茶褐素的含量；比色法测定茶多酚的含量；NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 体系分光光度法和三氯化铝比色法测定总黄酮含量；茚三酮比色法、甲醛滴定法和氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量等。现将普洱熟茶中主要成分的检测方法和测定结果列于表1。

表1 普洱熟茶中主要成分的检测Table 1 Determination of the main components in fermented Pu-erh tea

如表1所示，除HPLC法之外，普洱熟茶主要成分的检测基本都是应用比色法原理。针对普洱熟茶中的主要成分，用不同的比色方法检测甚至同一方法测定出的结果差异非常显著。不同的文献中应用系统比色法检测普洱熟茶中茶褐素结果显示，含量在1.66%～31.33%之间，前后相差近19倍；茶红素和茶黄素的检测结果相差更是达到了60倍以上；茶多酚的检测结果差异亦达20倍；总儿茶素、游离氨基酸、茶多糖和总黄酮检测结果最大相差百倍以上。

2 影响普洱熟茶主要成分检测的问题分析

虽然检测样品的来源不同、提取方法的不同等诸多因素均会影响普洱熟茶主要成分检测的结果，但普洱熟茶中的茶褐素可能是导致检测结果巨大差异的主要原因。研究表明，普洱熟茶提取物中含有氧化型茶多酚 （即茶褐素），可与多糖、蛋白、咖啡碱等结合形成复合物，且带有较深的红褐色[33-34]，这可能会对比色法原理应用于普洱熟茶成分检测带来严重干扰。

已有研究表明，若先对普洱熟茶用水提取（或将普洱熟茶粉直接溶于水），再进行80%醇沉，然后用0.5 mol/L的盐酸溶液在40℃下水解30 min，用聚酰胺层析柱分离洗脱，最后用苯酚-硫酸法测定茶多糖的含量[32]，可有效去除普洱熟茶中茶色素等物质的干扰，较准确测定出水溶性茶多糖的含量约为6%，而直接用苯酚-硫酸法测出多糖的含量为18%左右。另有研究表明，普洱熟茶的化学成分十分复杂，熟茶样品在540 nm处没有明显的吸收峰，用酒石酸亚铁比色法可能不适合检测普洱熟茶样品中茶多酚的含量[35]。因此，运用比色法原理测定普洱熟茶中主要成分的准确性有待进一步考证[36]。

谭超等[37]研究表明，茶褐素的形成机理是儿茶素氧化产物与多糖、蛋白质、核酸等非酚性物质参与合成的非透析性高分子聚合物，其组成十分复杂，它是一类性质类似于红茶茶褐素的高聚合物，能溶于水而不溶于乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等有机溶剂，主要由含多苯环的褐色色素、多糖残基、蛋白残基组成，主要的功能性基团为羧基、羟基、氨基以及甲基等，具有酚类物质特性。因此，茶褐素的这些特性，不仅严重干扰普洱熟茶中主要成分的含量测定，也会对其组分分离带来不利影响。

3 普洱熟茶主要成分的分离研究进展

由于咖啡碱和没食子酸等小分子物质的含量和结构及其生物活性相对清楚，其提取和分离方法亦相对确定和成熟。因此，对普洱熟茶主要成分的分离、纯化研究主要集中于茶褐素和茶多糖这两类区别于其他茶类的特征性物质，文章亦就这两类物质的分离、纯化研究进展进行综述。

3.1 普洱熟茶茶褐素的提取和分离

李连喜[35]研究表明，茶褐素属酚类物质，含有羟基、烷基、羧基及苯环类物质，相对分子质量较大，多次柱分离后，茶褐素组分的重均相对分子质量（Mw）为 2878，数均相对分子质量（Mn）为 2120，多分散性指数为1.36。红外光谱和理化性质分析表明，茶褐素主要是由酚和羧酸类物质构成，并含有蛋白质、糖等化合物。茶褐素中起主要络合作用的羧基和酚羟基等主要酸性基团还可与金属发生络合作用[38]。茶褐素形成机制可表述为微生物分泌的酶的酶促反应及其反应产物与成分间的偶联氧化、聚合[39]。也有研究显示茶褐素为多羟基物质，其中含有烷基、苯环、羧基、多糖残基、蛋白残基等基团[40]。

浸提条件对茶褐素提取率有较大影响，一般情况下，普洱熟茶茶褐素的提取流程如下：普洱熟茶→粉碎→无水乙醇浸泡→过滤→茶渣→热蒸馏水浸泡→离心抽滤→合并滤液→减压浓缩→二氯甲烷萃取2次→乙酸乙酯萃取3次→正丁醇萃取4次→水相减压浓缩→加无水乙醇→抽滤→收集沉淀→干燥→茶褐素[3，36]。水浴综合浸提普洱熟茶多酚和茶褐素的最佳工艺参数为：温度100℃，时间60 min，液料比为1∶25，此时茶多酚含量可达到9.04%，茶褐素提取率可达到93.15%。对茶褐素提取物进行成分分析，结果如表2所示。

表2 普洱熟茶茶褐素提取物的成分分析Table 2 The component analysis of theabrownin extracted from Pu-erh tea

由表2可知，所谓的茶褐素提取物，检测到的茶褐素仅占35.30%～44.83%，其中还包含茶黄素、茶红素、茶多糖、蛋白质等其他物质[41]。除浸提法以外，王天禄等[42]也尝试通过比较不同树脂对茶褐素的吸附与解吸能力，选择AB-8大孔树脂、DEAE-52阴离子交换树脂等对普洱茶茶褐素进行分离，得到的不同组分的茶褐素中仍然含有多糖、蛋白质等物质。另有张钦等[43]以“紫娟”普洱熟茶为原料，分离制备茶褐素，采用膜技术对茶褐素分级，结果表明，“紫娟”普洱茶茶褐素属苯多酚类物质，并含有酚性色素、多糖、蛋白质、脂类及生物碱等。杨新河等[44]采用羟丙基葡聚糖凝胶柱层析对普洱熟茶水溶性色素进行分级研究，研究结果亦再一次证明了普洱熟茶水溶性茶色素组成与性质的复杂性。

由此可见，普洱熟茶中的茶褐素与红茶中的色素类物质可能有很大区别，主要体现在前者是在长期渥堆发酵、微生物充分参与的环境中形成的，并在此过程中与多糖、蛋白、脂质、生物碱等物质结合成为高聚物[33-34]，而红茶中的色素形成过程是在红茶短期“发酵”（实为有氧氧化，微生物作用较少）的相对简单环境中进行，与其它成分的相互作用亦相对简单。普洱熟茶中茶褐素与其它成分的相互作用也导致了其分离组分的具体成分一直未能完全明确，乙酸乙酯萃取组分、正丁醇萃取组分不清楚[44-45]，研究结果仅停留在对其特征的推测性描述[46]。

3.2 普洱熟茶茶多糖的提取和分离

普洱熟茶多糖的分离纯化包括水提、醇沉、脱蛋白、脱色等，提取物含有中性糖蛋白、酸性糖蛋白等[47]。一般的普洱熟茶多糖提取工艺流程如下：茶样→85℃热水浸泡→茶汤→乙醇浸泡→茶渣→热水溶解→滤液→浓缩液→氯仿萃取→水层→乙酸乙酯萃取→水层→正丁醇萃取→水层→无水乙醇→沉淀→热水溶解→溶液→浓缩、40%乙醇溶解→茶多糖。

有研究认为，茶多糖是一类与蛋白质结合的非还原性杂多糖[6，48]，含有糖醛酸，而且还含有多酚氧化产物，说明多糖未能与多酚氧化产物分离[49]。普洱熟茶中多糖提取率可达12%[50]，也有研究表明多糖提取仅为1.7731%[51-52]，而且水、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯仿等不能将氧化型茶多酚、可溶性糖和咖啡碱等物质较好分离[53]。茶原料、发酵的微生物种类以及发酵时间等因素对普洱熟茶中茶多糖的分子量都有影响。

关媛[54]以及杨新河等[55]研究了树脂对普洱茶多糖脱色和蛋白质去除的效果及DEAE-52纤维素离子交换树脂对普洱茶多糖的分离效果。结果表明，D101树脂适合于对普洱茶多糖同时脱色和蛋白质去除，但普洱茶多糖的脱色率只能达到82.33%，蛋白质去除率仅为70.89%。总之，氧化型茶多酚也具有醇沉性，因此用醇沉法提取普洱熟茶中的多糖并不可取，且氧化型茶多酚与多糖之间的复杂相互作用导致了普洱熟茶多糖的分离研究至今尚未明确[56]。

4 展望

综上关于普洱熟茶成分分析与分离的研究表明：不同研究人员或者方法所得的普洱熟茶成分含量测定结果相差较大，这可能与其在加工过程中长期的湿热变化和微生物作用等因素有关，因为这些因素导致其中的多酚类物质氧化、聚合形成红褐色的色素类物质，并与其它组分相互结合，从而对很多基于比色原理的检测带来较大干扰。此外，普洱熟茶中茶褐素与其它组分的相互作用亦导致普洱熟茶主要成分（茶褐素和茶多糖等）的分离难以实现。总之，常规的茶叶成分分析和分离方法可能并不适用于普洱熟茶。

研究表明，普洱熟茶加工过程中的主要化学变化包括：（1）在微生物的作用下，茶叶中的淀粉、纤维素、多聚糖、果胶等多糖以及蛋白质等大分子被部分降解；（2）多酚类物质因茶叶细胞遭到破坏而暴露，并在湿热作用和微生物作用等条件下发生氧化聚合反应。氧化型茶多酚因其多聚酚羟基等特殊结构而能与咖啡碱、糖类物质、蛋白质、脂质等相互作用，并以非共价键的形式形成大分子复合物，这也正是用常规方法难以对普洱茶主要成分进行分析和分离的主要原因。

鉴于普洱熟茶原料（茶鲜叶或晒青毛茶）的成分清楚，且其发酵过程（包括发酵过程中的化学环境、微生物种类、酶的种类、湿热作用情况等）已基本明确，不妨尝试以已知的原料成分和发酵过程中的化学变化为依据，进而对普洱熟茶成分及其含量进行判定，这可能更易于阐明普洱熟茶的成分组成、保健功效物质基础和作用机理。