甘姜苓术汤中总多糖的提取工艺研究

刘晓芳，梁惠珍，闫江娜，李 婷

(山西中医药大学，山西晋中 030619)

甘姜苓术汤原名肾着汤，出自《金匮要略。五脏风寒积聚病脉证并治第十一》［2］，该方由四味药材组成，分别为甘草、干姜、茯苓、白术。在《金匮要略》中用来治疗肾着病，临床表现为“身体重，腰中冷，如坐水中，反不渴，小便不利，饮食如故，．．．．．．．腰以下冷痛，腹重如带五千钱［3］。现代药理研究表明此方在治疗慢性盆腔疼痛等方面具有显著疗效［4］。此方中有大量的多糖类成分，近年来植物多糖药理作用研究进展表明多糖在抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、抗炎、抗溃疡、降血糖、降血脂、抗凝血及提高免疫功能等方面有显著的作用［5］。该实验中首先根据单味药材提取多糖的方法，采取正交试验法确定多糖的最佳提取工艺，结合苯酚－硫酸法显色，用紫外可见分光光度法测定甘姜苓术汤中多糖的含量。

1 材料

1．1 仪器

FA224电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，TU－1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，HH－2数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，SHZ－D(III)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，冰箱(合肥美菱股份有限公司。

1．2 试剂与药材

浓硫酸(分析纯)，苯酚(分析纯，批号:20160516)，葡萄糖(分析纯，批号:20110214)，95% 乙醇(分析纯，批号:20150206)，干姜(安徽谓博中药饮片有限公司 批号:180101)，茯苓(安徽谓博中药饮片有限公司，批号:180101)，甘草(安徽精诚本草中药饮片有限公司，批号:171001)，白术(安徽精诚本草中药饮片有限公司，批号:171001)

2 方法与结果

2．1 绘制标准曲线

2．1．1 对照品溶液的制备

称取于104℃下烘至恒重的无水葡萄糖25．3 mg，精密称定，放置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，从中吸取8 mL置于50 mL容量瓶中，加入蒸馏水至刻度定容，摇匀，制得0．0810 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

2．1．2 供试品溶液的制备

依据处方称取药材(甘草6 g，干姜12 g，茯苓12 g，白术6 g)，精密称取，参照本实验确定的最佳提取条件，加入12倍量的水，煎煮30 min，煎煮三次，完成后，经纱布和棉花过滤，合并滤液，浓缩至50 mL，冷却至室温，加入95%乙醇使其含醇量达到80%，放入冰箱中冷藏24 h，抽滤。每次用80%乙醇10 mL洗涤残渣，共两次。将所得滤饼在54℃下的烘箱中烘至恒重。精密称取0．1 g干燥样品，放于50 mL容量瓶中，加入蒸馏水至刻度定容，从中吸取3 mL于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，即可得到供试品溶液。

2．1．3 检测波长的确定

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液1．0 mL，放于10 m L试管中，用移液管精密吸取1．0 mL蒸馏水加入到试管中使其补至2 mL，再精密吸取1．0 m L 5%的苯酚溶液(现配现用)，摇匀，立即精密加入5．0 mL的浓硫酸 ，摇匀，沸水浴20 min［6］水浴完成后将其取出放置冷却到室温，配制相应的试剂作为空白，在350～700 nm［7］波长范围下进行扫描，供试品和标准品溶液在490 nm处均有最大吸收峰，故确定490 nm为方中多糖的最佳检测波长

2．1．4 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液 0．2、0．6、0．8、1．0、1．4 mL，将其分别置于10 mL试管中，分别用移液管精密吸取蒸馏水使其补至2 mL，再精密吸取1．0 mL5%的苯酚溶液(现配现用)加入试管中，摇匀，立即精密吸取浓硫酸5．0 mL加入到试管中，摇匀，配制相应试剂作为空白，将6支试管沸水浴20min，水浴后将试管取出，放置冷却到室温，用紫外可见分光光度计于490 nm波长下进行测定，得到吸光度分别为 0．068、0．279、0．380、0．487、0．709，以对照品溶液的浓度为x轴，以吸光度为y轴绘制标准曲线。

图1 标准曲线图

由图1可见，得到回归方程 y=52．674x－0．0418(r=0．9998)，由此可得到葡萄糖溶液浓度在 0．002024 ～0．014168 mg/mL范围内与吸光度有良好的线性关系。

2．2 最佳提取条件选择

2．2．1 正交试验设计

参考有关文献［8－9］，选择料液比为(A)、煎煮时间为(B)、煎煮次数(D)为因素，选用L9(34)为正交表进行正交试验，以原药材中总多糖的含量作为指标，确定最佳提取工艺。

表1 正交试验因素水平表

2．2．2 正交试验结果

表2 正交试验结果及直观分析表

分析可得，表2中，影响甘姜苓术汤中总多糖的提取率的因素主要是D，将C为误差进行方差分析，表3可见，显示结果为ɑ=0．10时，D对甘姜苓术汤中总多糖的提取具有很明显的影响，而A和B两个因素则没有显著影响，我们选择最佳的提取条件为A1B1D3，结果为煎煮次数为3次，煎煮时间为30 min，加入水量为12倍的药材量。

表3 正交试验方差分析表

2．3 方法学考察试验

2．3．1 精密度试验

分别精密吸取1．0 mL葡萄糖对照品溶液6份，依据2．1．3项下的方法测吸光度，测得吸光度分别为 0．478、0．477、0．454、0．468、0．437、0．467，计算可得 RSD 为1．86%(n=6)，由此可说明该方法的精密度较好。

2．3．2 重复性试验

精密称取于54℃下烘至恒重的干燥样品0．1 g，称取6份(0．1000、0．1014、0．1020、0．1013、0．1012、0．1008 g)，分别放于50 mL的容量瓶中定容至刻度，再从中精密吸取1．0 mL于10 m L的容量瓶中定容至刻度，摇匀，精密吸取0．5 mL溶液分别放于试管中，依据2．1．3项下的方法测定吸光度，吸光度依次为0．322、0．324、0．340、0．331、0．349、0．336，根据标曲计算样品中总多糖的含量，计算得样品中总多糖的含量依次为552．53、547．90、568．50、558．93、586．50 mg/g，求得平均含量为 563．93 mg/g，RSD为2．30%，由此可得出此方法的重复性较好。

2．3．3 稳定性试验

精密吸取1．0 m L的供试品溶液，依据2．1．3项下的方法测定吸光度，在13、28、42、60、85、120 min 进行测定，得到吸光度分别为 0．505、0．483、0．506、0．507、0．513、0．456，计算得 RSD为4．38%(n=6)，由此可说明该方法下供试品显色后至少两小时内的稳定性良好。

2．3．4 加样回收率试验

精密称取于54℃下烘至恒重的干燥样品0．05 g，平行取六份，分别为(0．0507、0．0500、0．0509、0．0504、0．0509、0．505 g)，再精密称取葡萄糖0．027 g，将称取的样品和葡萄糖放入50 mL容量瓶中定容至刻度，从中精密吸取1．0 mL于10 mL容量瓶中定容，摇匀，各精密吸取0．5 m L，依据2．1．3项下的方法测定其吸光度，吸光度分别为 0．312、0．320、0．330、0．319、0．316。可以计算出回收率，见表4，从表4中可见平均回收率为99．89%，RSD=3．18%。表明本实验确定的多糖提取工艺回收率高、准 确性较好。

表4 甘姜苓术汤中总多糖的加样回收率试验

2．4 样品含量测定

根据正交试验确定的此方中多糖的最佳提取工艺，进行供试品的制备，根据2．1．2项下的方法平行制备三份供试品溶液，分别精密吸取1．0 mL溶液，制备相应的空白试剂，按2．1．3方法在490 nm 下测定吸光度，含量分别为 42．11、43．52、45．48 mg/g，生药材中总多糖的平均含量为43．70 mg/g。

3 讨论

本实验中采用苯酚－硫酸法测定甘姜苓术汤中总多糖的含量，以葡糖糖溶液作为对照品，在波长490 nm下测定其吸光度，将数据代入回归方程中可求得总多糖的含量。葡萄糖溶液浓度在0．002024～0．014168 mg/mL范围内与吸光度有较好的线性关系，平均回收率为99．89%，RSD=3．18%，生药材中总多糖的平均含量为43．70 mg/g，该方法易于操作，且灵敏度较高，线性范围较宽，有很好的重复性，因此可用于甘姜苓术汤总多糖的含量测定。