刺参粗多糖对糖酵解与有氧氧化过程关键酶活性的影响

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(大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600)

能量代谢是有机体在物质代谢中能量的产生、释放、转换及利用的过程。细胞的主要能量来源为糖代谢,葡萄糖在体内主要以糖酵解和氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation,OXPHOS)两种途径进行氧化分解,其中OXPHOS是糖代谢的主要方式[1]。肿瘤细胞具有多种典型的特征,代谢异常是肿瘤细胞十大显著特点之一[2]。肿瘤糖代谢异常十分关键,德国生理学家Warburg提出了著名的“Warburg效应”[3],即在供氧充足时,肿瘤细胞大多通过糖酵解途径产能,并产生大量的乳酸,却很少利用产能更高的OXPHOS。癌细胞与正常细胞的能量代谢方式不同,正常细胞有氧条件下以有氧氧化为主,只有供氧不足时才会以糖酵解途径供能,而癌细胞无论是有氧还是缺氧条件下均优先以糖解途径供能,这种能量代谢方式使其在缺氧条件下具有更强的耐受能力[4],同时推测线粒体代谢异常是肿瘤发生的基础[5]。肿瘤以细胞能量代谢途径转换为特点,从正常细胞依赖的OXPHOS产能向糖酵解产能的转换[6]。在糖酵解过程中有多种关键酶,如己糖激酶(Hexokinase,HK)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(3-glyceraldehyde phosphate delydrogenase,GAPDH)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)等,这些酶的活性高低直接影响糖酵解途径[7],这些糖酵解关键酶也在恶性肿瘤细胞中高度表达,若抑制糖酵解关键酶,阻断糖酵解途径,从而切断肿瘤的能量供应,则可抑制大多数肿瘤细胞中能量的合成,从而减缓肿瘤细胞的增殖与发展[8]。近年来,线粒体在肿瘤发生、发展中的作用及在癌症诊断治疗中的意义日益受到关注。对于OXPHOS的关键酶,如丙酮酸脱氢酶(Pyruvate Dehydogenase,PDH)、线粒体复合体Ⅰ、线粒体复合体Ⅴ(ATP合酶)等,通过提高其活性来促进OXPHOS产能,进而有可能抑制癌细胞的增殖。

海参自古以来就被奉为营养佳品,营养价值主要源于由氨基半乳糖、己糖醛酸、岩藻糖、硫酸基组成的多糖[9],其糖链的部分羟基可发生硫酸酯化,且硫酸化程度与其抗肿瘤作用相关[10]。研究发现海参多糖具有明显的抗肿瘤活性,其抑瘤率为73.56%[11],海参多糖在体外呈浓度依赖性促进人肾癌细胞786-0凋亡[12],北极海参多糖具有较强的体外抗肿瘤作用[13]。目前海参多糖的抗肿瘤作用研究较多,但是对其与糖酵解与有氧氧化的联系方面报道较少。

刺参具有“海参之冠”之称,本文选用刺参粗多糖(Stichopusjaponicuscrude polysaccharides,SJP)为研究对象,从改善线粒体生物能学即激活氧化磷酸化产能,抑制糖酵解产能的角度探索其防癌机制,为癌症研究提供新的视角、新的思路和新的希望。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明种小鼠 雄性,重量(22.13±0.95) g,24只,大连医科大学动物实验中心(合格证号:SCXK 2014-0002);干刺参 大连晓芹食品有限公司;木瓜蛋白酶(酶活80万U/g)、胃蛋白酶(酶活3000～3500 NFU/g)、胰蛋白酶(酶活>250NFU/mg) 北京索莱宝科技有限公司;LDH试剂盒(生产批号:20171028)、GAPDH检测试剂盒(生产批号:20171108)、HK测试盒(生产批号:20171102)、PDH试剂盒(生产批号:20171102)、线粒体复合体Ⅰ活性试剂盒(生产批号:20171102)、线粒体复合体Ⅴ活性测试盒(生产批号:20171102) 北京索莱宝科技有限公司;牛血清白蛋白 荷兰Boehringer Mannheim公司;考马斯亮蓝G-250染色液 美国Fluka公司;其他试剂 均为国产或进口分析纯。

中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;TGL-18M台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;92-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;Polystat 34恒温水浴锅 美国Techne公司;UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SJP的提取

1.2.1.1 木瓜蛋白酶水解法提取SJP 用中草药粉碎机将干刺参粉碎,过60目筛,所得为刺参干粉,称取刺参干粉10 g,加入丙酮溶液60 mL于4 ℃浸泡24 h,倒出丙酮溶液,刺参粉室温(20 ℃)下挥发完全,然后放置24 h(20 ℃),向挥出丙酮的刺参干粉中加入木瓜蛋白酶1 g与0.1 mol/L的乙酸钠缓冲液(pH为6.0,含半胱氨酸盐酸盐和乙二胺四乙酸二钠的浓度为5 mmol/L)300 mL,60 ℃水浴24 h。取出冷却,10000 r/min 20 ℃离心5 min,收集上清液。向上清液中加入10%的氯化十六烷基吡啶溶液(w/v)16 mL,静置24 h,分层后6000 r/min 20 ℃离心20 min,收集沉淀。用20 mL NaCl乙醇溶液(3 moL/L NaCl溶液:乙醇=100/15 v/v),将沉淀完全溶解。向溶解液中加入95%乙醇溶液40 mL,充分搅拌后4 ℃静置12 h过夜。溶液分层后6000 r/min 4 ℃离心20 min,用10 mL 80%和95%乙醇溶液洗沉淀2～3次后,60 ℃烘干2 h,即得SJP,采用硫酸苯酚法[14]测定糖含量,计算SJP糖部分含量为30%,考虑到糖链上有部分羟基发生硫酸酯化的影响,且硫酸基含量占多糖的30%左右[15],故实际SJP多糖含量约为60%。

1.2.1.2 胃蛋白酶与胰蛋白酶水解法提取SJP 具体操作方法参照文献[16],所得SJP以硫酸苯酚法测定糖含量,经计算为33%,考虑到硫酸基的影响,故实际SJP多糖含量约为63%。

1.2.2 动物分组与处理 实验用清洁级小鼠,适应性饲养1周后随机分成正常对照组、SJP 1组(木瓜蛋白酶水解法制备的刺参多糖)、SJP 2组(胃蛋白酶与胰蛋白酶水解法制备的刺参多糖),每组8只小鼠,称重(g),给药10 d,观察小鼠状态。SJP组灌胃剂量为200 mg/kg/d,每日1次,正常对照组小鼠每天灌胃等体积生理盐水。结束后记录灌药后鼠重(g),处死小鼠,迅速取出肝脏、骨骼肌等组织,进行相应处理并检测HK、GAPDH、LDH、PDH、线粒体复合体Ⅰ与复合体Ⅴ活性等各项指标。

1.2.3 糖酵解关键酶活性测定 检测糖酵解过程中关键酶HK、GAPDH、LDH活性。

HK活性测定用小鼠肝组织,GAPDH与LDH活性测定用小鼠股四头肌。按照相应的试剂盒说明书进行实验操作并计算结果。

1.2.4 有氧氧化关键酶活性测定 检测糖有氧氧化过程中关键酶PDH、线粒体复合体Ⅰ与复合体Ⅴ活性。PDH、线粒体复合体Ⅰ与复合体Ⅴ活性用小鼠肝组织进行测定。按照相应的试剂盒说明书进行操作并计算结果。

1.2.5 生物能指数测定 生物能指数是指线粒体的ATP合酶(复合体Ⅴ)与糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(3-GAPDH)的活性比。复合体Ⅴ与3-GAPDH的活性已分别在1.2.3与1.2.4中进行测定。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 糖酵解关键酶活性分析

糖酵解是肿瘤细胞能量供应的重要手段,肿瘤糖酵解活性的升高在细胞水平表现为乳酸生成与葡萄糖消耗比的增加[17],糖酵解过程产生的中间代谢产物又可被肿瘤细胞利用,用于合成细胞增殖所需的原料,从而促进肿瘤的增殖、迁移等。研究发现,小鼠乳腺癌细胞的糖酵解活性约是正常细胞的2～17倍[18]。

糖酵解过程有赖于关键性酶的催化。HK催化糖酵解的启动步骤,使葡萄糖磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸,HK 4种亚型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)在正常细胞中通常低表达,而在多种肿瘤细胞中呈现高表达[19],王秀等[20]研究表明,可通过降低卵巢癌细胞中的HK活性,抑制卵巢癌细胞增殖。由表1可知,灌药组小鼠HK活性与对照组相比均下降,且呈现显著性(p<0.05)差异,SJP 1组HK活性高于SJP 2组,但两组间无显著性差异(p>0.05),说明SJP能抑制HK活性,从而抑制糖酵解过程的第一步,使产能向OXPHOS方向进行。

表1 SJP对糖酵解酶活性的影响Table 1 Effects of SJP on glycolytic enzyme activity

GAPDH催化甘油醛-3-磷酸形成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH在多种癌症中上调,如肝癌、肺癌,但其具体作用及机制尚不明确。研究表明GAPDH能够激活细胞增殖,加剧肝癌的发生发展。因此得出GAPDH可以促进癌症的发生[21]。而实验结果表明与对照组相比,灌药组小鼠GAPDH活性均降低,且呈现显著性差异(p<0.05),SJP 1组GAPDH活性高于SJP 2组,说明SJP可抑制GAPDH活性,进而可能阻止癌症的发生。

LDH催化丙酮酸生成乳酸,是糖酵解过程最后一步反应的催化酶,推动着糖酵解循环的进行。LDH有5种同工酶,其中乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)与肿瘤的发生最为密切。c-Myc上调LDHA基因的表达,使得肿瘤细胞进行高效有氧糖酵解,并可促进肿瘤的生长[22]。已有研究报道,LDHA在神经胶质瘤中有较高表达,而在正常的神经组织和细胞中的表达较低[23]。灌药组小鼠的LDH与对照组比较均下降,且呈现显著性差异(p<0.05),SJP 1组LDH活性高于SJP 2组,说明SJP可抑制LDH活性,进而抑制糖酵解过程。总之,SJP能抑制HK、LDH和GAPDH的活性,进而抑制糖酵解的进行,影响其产能,推测SJP可能具有抑制肿瘤增长与扩散作用。

2.2 有氧氧化关键酶活性分析

线粒体OXPHOS是机体的重要能量来源,由线粒体内膜呼吸链完成,呼吸链复合体是主要参与者。正常生理状态下,人体80%以上的能量来源于线粒体OXPHOS[24]。PDH是丙酮酸的关键调节剂,在线粒体中将丙酮酸转变为乙酰辅酶A,进入三羧酸循环进而通过OXPHOS产能。PDH活性的重要调节剂是PDH激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK),通过促使PDH特定丝氨酸位点的磷酸化使PDH失活[25],导致丙酮酸进入线粒体的量减少,生成大量的乳酸。一些PDK的亚型在各种肿瘤细胞中过度表达[26],且对维持肿瘤有氧糖酵解起到重要作用。若提高PDH活性则可促进丙酮酸进入三羧酸循环,使产能向OXPHOS方向进行。

线粒体呼吸链复合体I是呼吸链电子传递的起始复合体,位于线粒体内膜上,将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所带电子通过FMN和Fe-S簇中的Fe原子传给泛醌,将质子从基质中转移到线粒体膜间腔,形成跨内膜的质子电化学梯度,驱动复合体Ⅴ合成ATP[27-28]。

复合体V是线粒体呼吸链的最后一个复合物,在线粒体中通过电化学梯度传递质子,以ADP、Pi及Mg2+为原料合成ATP,为细胞供能[29]。线粒体呼吸受损引起的NADH升高可导致Akt通路的激活,Akt通路的激活可促进肿瘤细胞的糖酵解[30]。

由表2可知,灌药组小鼠的PDH、线粒体复合体I、复合体V的活性与对照组相比均有所升高,且呈现显著性差异(p<0.05),SJP 1组PDH、线粒体复合体I、复合体V的活性均低于SJP 2组,且两组间均无显著性差异(p>0.05),说明SJP可促进上述酶的活性,进而促进OXPHOS进行,如果可以调节肿瘤代谢途径,控制肿瘤的能量代谢方式,使其向OXPHOS产能方向进行,进而抑制肿瘤细胞增殖,则可以有针对性的治疗恶性肿瘤。

表2 SJP对有氧氧化酶活性的影响Table 2 Effects of SJP on aerobic oxidase activity

2.3 鼠重与生物能指数分析

多种肿瘤细胞中都存在线粒体功能紊乱,线粒体功能异常在肿瘤发生发展的各个阶段也扮演重要的角色。

由表3可知，灌药前SJP组鼠重与对照组比较均无显著性差异(p>0.05),灌药后SJP组与对照组比较均有所增加,且SJP 2组存在显著性差异(p<0.05),SJP组灌药前与灌药后鼠重均增加且存在显著性差异(p<0.05),说明SJP对小鼠的生长有促进作用。灌药后小鼠好动,毛色光鲜顺滑。

表3 SJP对鼠重与生物能指数的影响Table 3 Effects of SJP on the weight of mice and bioenergetic index

生物能指数是指线粒体的ATP合酶与糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性比,其决定肿瘤的侵袭性,生物能指数也从侧面说明了线粒体的活性高低。SJP组的生物能指数与对照组相比均有所升高,且有显著性差异(p<0.05),SJP 2组有较显著差异(p<0.01)。SJP使生物能指数升高,说明其使小鼠更倾向于OXPHOS产能,从而可能利于抑制肿瘤的侵袭。

3 讨论与结论

Warburg效应在各种恶性肿瘤细胞及肿瘤组织中普遍存在,例如乳腺癌、肝癌、胃癌及脑组织恶性肿瘤等[31-32],大部分恶性肿瘤已经显示糖酵解效率和乳酸产量均上调[33]。Warburg效应不仅增强了糖酵解作用,同时也通过将丙酮酸转化为乳酸而抑制了线粒体OXPHOS的作用。糖酵解为肿瘤细胞的生存和侵袭提供了优势条件,有益于肿瘤细胞的侵袭和转移[34]。研究表明,为了适应周围微环境,肿瘤细胞可能通过异常信号通路重排代谢方式,重排的代谢方式有利于维持肿瘤的生长增殖等[35]。另一方面,为了对自身起到有效的适应性保护,肿瘤细胞需要大量能源来维持高耗能的耐药通路,对糖酵解的依赖进一步增加[36]。因此,如果能够对肿瘤细胞的代谢方式进行有效转变,就有可能遏制肿瘤细胞恶性增殖,并改善肿瘤细胞对治疗药物的敏感性。本文实验结果表明两种方法提取的SJP均能抑制糖酵解关键酶活性,促进OXPHOS过程关键酶活性,说明SJP有可能通过改变代谢方式来抑制癌症的发生,但其具体的作用机制还需更进一步探索。