香加皮精多糖的单糖组成、热重和热裂解分析

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(河南农业大学烟草学院,河南省香精香料与调香工程技术研究中心,河南郑州 450002)

多糖为单糖的聚合物,在理化性质方面具有无毒副作用、热稳定、大比表面积、缓释性、乳化性、吸水性、保湿性等特征[1-3],因此,多糖被广泛开发用于药物缓释、面膜保湿、烟草保润等领域[4-11]。有研究表明,多糖作为保润剂的同时还具有卷烟加香效果,许春平等[12]对从香料烟中提取的多糖在氮气氛围下进行热裂解产物分析,发现香料烟多糖可以分解出99种成分,如5-甲基-2-糠醛、糠醛、吡咯等;黄芳芳等[13]对铜藻多糖进行热裂解分析发现,铜藻多糖可以裂解成多种杂环类、酮类和醛类物质,感官评价结果显示,添加铜藻多糖的样品在改善回甜感、圆润感、柔和度方面均有提升;杨君等[14]将裂片石莼多糖添加到卷烟中进行感官评价,发现添加后对感官质量有总体提升,烟气透发性变好,烟气变细腻等。这些文献表明,多糖加热可以裂解成多种丰富的化学成分。然而,由于不同植物的多糖组成、分子量大小均有差异,因此热裂解产物会有所不同。

香加皮(Cortex Periplocae),源于萝藦科植物杠柳(PeriplocasepiumPunge.)的干燥根皮,常用传统中药,对于祛风湿、心悸气短、腰膝酸软、强筋骨、慢性心力衰竭等有非常好的效果[15-17]。研究发现,香加皮含有丰富的化学成分,如萜类、糖苷类、多糖类等[18-19]。然而,关于香加皮多糖的研究较少,尽管已有少数文献[19]对香加皮多糖进行初步分离并检测,初步判断有甘露糖和乳糖。但对香加皮精多糖的组成、热重和热裂解未进行更深一步的研究。本实验在前期研究香加皮多糖的提取、纯化、结构鉴定和抗氧化活性的基础上[20],进一步研究了香加皮精多糖的单糖组成、热重性质和热裂解产物,以期为香加皮多糖在更广泛的使用上提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香加皮精多糖 实验室自制[20];标准品(纯度>98%):阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、肌醇六乙酸酯 北京索莱宝科技有限公司;三氟乙酸、二氯甲烷、盐酸羟胺、醋酸酐 天津市大茂化学试剂厂。

BF-2000型氮吹仪、ZRT-B型热重分析仪 北京京仪高科有限公司;Agilent 7890B-5977A型气相色谱质谱联用仪、HP-5MS毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国安捷伦科技有限公司;5250-T型热裂解仪 美国CDS。

1.2 实验方法

1.2.1 精多糖单糖组分的定量分析 香加皮精多糖CPP1、CPP2和CPP3由本实验室提前制备,香加皮原料经过脱脂、脱色、透析等处理得到香加皮粗多糖,香加皮粗多糖经过离子交换色谱DEAE-52纤维素和葡聚糖凝胶色谱 Sephadex G-100进行分离纯化,分别得到香加皮精多糖CPP1、CPP2和CPP3。其具体制备方法见文献[20]。制备好的精多糖通常置于-18 ℃冰箱中保存,实验之前取出并在50 ℃烘箱中干燥2 h。

1.2.1.1 精多糖的酸水解 采用三氟乙酸水解法对精多糖进行水解[21-22]。分别准确称取三种香加皮精多糖各10 mg置于10 mL具塞比色管中,加入8 mL浓度为2 mol/L三氟乙酸(TFA),放入110 ℃烘箱下充分反应4 h进行水解。反应结束后,冷却至室温,在反应液中滴入少量甲醇,低压旋转蒸干(50 ℃、0.09 MPa、15 min),如此反复3次使TFA完全挥发干净。

1.2.1.2 衍生化处理 采用柱前衍生化方法[23]，向水解后的香加皮多糖中加入0.5 mL吡啶和5 mg盐酸羟胺,放入90 ℃烘箱中反应0.5 h,然后取出静置冷却至室温25 ℃,再加入0.5 mL醋酸酐,继续在90 ℃条件下进行乙酰化反应0.5 h,用氮吹仪吹干,得到糖腈乙酸酯衍生物,准确加入1.0 mL二氯甲烷溶解后采用GC-MS进行检测。所有的单糖标准品按照同样的方法进行衍生化处理,用内标法定量多糖样品中的单糖组分,肌醇六乙酸酯作为内标物。

GC-MS条件为程序升温,柱温130 ℃保持6 min,以4 ℃/min至240 ℃,保持20 min,载气为He,进样口温度250 ℃,分流比1∶50,柱流速1 mL/min。质谱条件:EI(70eV),接口温度250 ℃,离子源温度250 ℃,扫描范围:m/z 50～550,扫描速率:2.9 scan/s。

1.2.1.3 定量分析 采用内标法对单糖组成进行定性和定量分析[24]。根据内标物(肌醇六乙酸酯)、标准品和样品的质量以及内标物、标准品和被测组分的峰面积求出样品中单糖的含量[25-27]。单糖含量按以下公式计算,然后再计算各单糖的摩尔比。

式中:Ai-样品中某单糖峰面积;AIi-样品中加入的内标物峰面积;AIs-标准样品中加入的内标物的峰面积;As-某单糖标准样品峰面积;ms-某单糖标准样品的质量,mg;mIs-标准样品中加入的内标物的质量,mg;mIi-样品中加入的内标物的质量,mg;m-称取糖样品的质量,mg。

1.2.2 精多糖的热重分析 按照文献[28]方法测试热重。准确称取2.00 mg精多糖,使用热重仪在氮气环境下精多糖温度由25 ℃高到900 ℃,升温速率为10 ℃/min,进行热重分析测定。

1.2.3 精多糖热裂解产物分析 取分别称量好的干燥的精多糖放入石英管中,用石英棉堵住两端,随后将石英管放入热裂解仪中,在氮气环境下进行热裂解实验。热裂解和GC-MS条件[29]为:

热裂解条件:起始温度:30 ℃,热裂解温度:300、600 ℃和900 ℃,升温速率为10 ℃/min,升到目标温度后保持时间10 s;

气相色谱条件:色谱柱:DB-5MS 弹性石英毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度:280 ℃;进样量:1 μL;分流比:50∶1;载气:氮气;升温程序:以2 ℃/min升温至50 ℃后保持2 min,再以2 ℃/min升至180 ℃,再以8 ℃/min速度升温至280 ℃,保持10 min;传输线温度为280 ℃。

质谱条件:电离方式:EI;电子能量:70 eV;电子倍增器电压:1600 V;质量扫描范围:30～500 amu;离子源温度:230 ℃;四极杆温度:150 ℃。利用NIST 11标准谱库检索,以匹配度≥80%者定性,使用峰面积归一化法计算各化合物的相对质量分数。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0进行数据处理,Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 香加皮精多糖的单糖组成

经过对三个精多糖的乙酰化衍生化GC-MS检测,结果显示三个样品均含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。段漓童等[19]曾经用薄层色谱和纸色谱的方法初步鉴别出香加皮多糖中含有乳糖和甘露糖。之所以与该文献有差别,可能是原料来源不同和检测方法不同造成的。实验得到各单糖组分之间的摩尔比,具体单糖组成的摩尔比见表1,其中CPP1中以葡萄糖和半乳糖为主,摩尔占比分别为76%和15%;CPP2中以半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖为主,摩尔占比分别为55%、17%和15%;CPP3中以葡萄糖、半乳糖和鼠李糖为主,摩尔占比为44%、34%和16%，GC-MS图谱见图1。

图1 各多糖的单糖组成GC-MS图Fig.1 GC-MS profile of aldononitrile acetate derivatives of monosaccharide composition注:单糖标准品(a):1:鼠李糖;2:阿拉伯糖;3:甘露糖;4:葡萄糖;5:半乳糖;6:内标;7:乳糖;CPP1(b);CPP2(c)和CPP3(d)。

表1 香加皮精多糖单糖组分的摩尔占比(%)Table 1 Major monosaccharide composition of the CPPs(%)

2.2 香加皮多糖热重分析

热稳定性是物质重要的理化性质之一,在多糖研究中常用热重分析仪在25～600 ℃或者25～900 ℃范围内,在空气或者保护气如氮气或氩气气氛中进行热稳定性分析[28-30]。文献研究表明[31-33],多糖一般在300 ℃以前稳定性较好,无明显的失重;无论是空气还是保护气气氛环境,多糖在300～400 ℃之间都有明显的失重发生;并在高于400 ℃以后失重速率逐渐降低;也由于卷烟燃烧区氧气含量极低,温度可达900 ℃。因此,为了模拟卷烟燃烧区过程,对香加皮精多糖选用25～900 ℃下的氮气气氛中进行研究。

2.2.1 CPP1热重分析 从香加皮多糖CPP1的热重曲线上可以看出(图2),整体CPP1的热重曲线分为四个阶段。第一阶段为从25 ℃升至300 ℃,这一阶段CPP1的失重率为7.67%。本阶段失去的是精多糖中的自由水即游离水。这部分水分靠分子间作用力即范德华力吸附,因此吸附力较弱。第二阶段在300～340 ℃,本阶段有明显的失重现象,失重率约68.63%。表明精多糖在本阶段受热大量分解。第三阶段在340～520 ℃之间,在这个阶段失重速率缓慢降低,表明精多糖逐渐分解完全。第四阶段在520～900 ℃,本阶段几乎无失重显现,说明精多糖在此之前已大部分分解。整体来看可知CPP1的热失重区间主要集中在300～520 ℃,总失重率约为95%。

图2 CPP1的热失重曲线Fig.2 Thermogravimetric curves of CPP1

2.2.2 CPP2的热重分析 多糖CPP2的热重曲线(图3)与CPP1整体趋势一致,但各阶段的温度节点有差异。CPP2热重曲线同样分为四个阶段。第一阶段在25～250 ℃,水分的散失主要集中在120 ℃以前,在此之后失重率变化很小,同样说明CPP2中主要含有自由水,几乎不含结合水。第二阶段在250～350 ℃之间,本阶段有明显的失重台阶,失重率约66%。表明样品在本阶段受热大量分解,温度节点与CPP1是不同的。第三阶段在350～540 ℃,本阶段精多糖失重率平缓下降,说明精多糖分解速率快速减慢且慢于第三阶段。第四阶段为550～900 ℃,几乎无失重现象。可以看出CPP2同样在前三阶段多糖已基本分解完全,总失重率约为88%。

图3 CPP2的热失重曲线Fig.3 Thermogravimetric curves of CPP2

2.2.3 CPP3的热重分析 多糖CPP3的热重曲线(图4)与CPP1和CPP2在800 ℃以前整体趋势一致,但各阶段的温度节点有差异。CPP3热重曲线也可分为四个阶段。第一阶段在25～250 ℃,水分的散失主要集中在120 ℃以前,在此之后失重率变化很小,同样说明CPP3中主要含有自由水,几乎不含结合水。第二阶段在250～350 ℃之间,本阶段有明显的失重台阶,失重率为70.52%。表明精多糖在本阶段大量受热分解。第三阶段在350～560 ℃,本阶段精多糖失重率平缓下降,说明精多糖分解速率减慢。第四阶段在560～900 ℃,不同的是,在本阶段的560～580 ℃之间有个小的失重台阶,失重率为4.85%,这是前两个多糖中没有出现过的,其具体原因还需进一步探究。之后在580～900 ℃,这一阶段比较平稳,已无明显的失重现象。可以看出CPP3在前三阶段多糖已基本分解完全,总失重率约为86%。

图4 CPP3的热失重曲线Fig.4 Thermogravimetric curves of CPP3

分析可知,尽管精多糖在实验之前已经在50 ℃下干燥2 h,但是仍然含有部分游离水,说明多糖对水有一定的吸附能力,这与文献中多糖的热重曲线是类似的[28]。CPP1、CPP2和CPP3热重曲线的总体规律一致,均有四个阶段。但三个精多糖的热重结果差异明显,CPP2和CPP3的热解温度区间在250～350 ℃,而CPP1在300～340 ℃,说明CPP2和CPP3比CPP1起始分解温度低;从最终保留率看,CPP1为5%,CPP2为12%,CPP3为14%,说明CPP1分解更彻底,而CPP2和CPP3较难以分解完全。在这一过程中,三个精多糖随温度变化的重量损失情况能被反映出来,但热裂解产物需要进一步通过GC-MS进行检测。

2.3 香加皮多糖热裂解产物分析

由于卷烟燃吸是在缺氧条件下进行的,为了模拟卷烟燃吸过程,研究者常在氮气氛围下考察香料或多糖的热裂解产物[29-30]。300、600和900 ℃分别代表了卷烟燃吸过程的三个温度区[34-38],本试验于该三个温度下进行热裂解,详细热裂解产物见表2。

表2 不同温度下三个香加皮精多糖的热裂解产物Table 2 Thermal cracking products of three scented polysaccharides at different temperatures

续表

根据香加皮多糖CPP1热裂解图和裂解产物(表2)可知,在300 ℃时,由于裂解温度较低,CPP1裂解不充分,裂解产物很少,识别出的化合物仅有7种,主要为糠醛、壬醛和5-羟甲基糠醛等,其中以糠醛含量为最高,达到15.23%。在600 ℃时,裂解产物明显增多,识别出23种化合物,含量较高的主要有糠醛、1,4:3,6-脱氢-α-右旋葡萄糖、2,4,5-三羟基嘧啶、麦芽醇、2-甲基-1,3-环戊二酮、5-甲基糠醛、棕榈酸6等,其中以含量最高的前两种为糠醛和2,4,5-三羟基嘧啶,分别达到23.44%和11.41%。在900 ℃时,裂解产物更多更复杂,识别出36种化合物,含量较高的主要有糠醛、角鲨烯、苯乙烯、5-甲基糠醛、2-甲基-1,3-环戊二酮、3-羟基-2-甲基-2-环戊烯-1-酮等,其中以含量最高的前两种为糠醛和角鲨烯,分别达到13.68%和4.56%。

如表2，与CPP1热裂解产物类似,CPP2和CPP3在300 ℃下裂解产物很少,均只识别出6种。在600 ℃时分别识别出30和29种,900 ℃下分别识别出31和33种。从三个多糖的裂解产物可以看出,总体上300 ℃时裂解产物较少,这是因为多糖类物质在这个温度以下稳定性较好。同时热重分析也表明,在300 ℃之前,热失重较小,多糖裂解不充分,因此裂解产物较少。此温度下裂解产物包含了糠醛、5-甲基糠醛、丙醛、2-甲基-1,3-环戊二酮、苯乙酸苯乙酯、2,5-二甲酰基呋喃等多种杂环类物质。这类物质也是卷烟烟气中常见物质,具有阈值低、香气丰富等特点,表明香加皮精多糖的裂解产物与烟气协调性较好,可以丰富卷烟香气。在600和900 ℃下裂解产物较多,同时热失重明显,裂解充分,裂解产物均以糠醛、5-甲基糠醛、2-甲基-1,3-环戊二酮、苯乙酸苯乙酯、2-甲基呋喃等较多,与文献[9,12-13]报道基本一致,这是糖类物质裂解产物的特征物质。

从分析鉴定的结果来看,香加皮多糖的热裂解产物主要可以分为四大类:

杂环类化合物,主要是一些吡啶、吡嗪、吲哚等化合物,如糠醛、5-甲基糠醛、吲哚、3-甲基吡咯、2-甲基吡啶等。这类物质可能是葡萄糖残基、半乳糖残基分解的产物。而吡咯、吡啶、糠醛等杂环类物质一般具有焦香、焦甜香,卷烟中添加的美拉德反应产物也属于此类物质[39],这类物质阈值较低,可以提高卷烟香气量,而且烟草和烟气中就含有大量的此类物质[40-43],因此与烟气协调性较高。

酮类、醛类、酯类、烯类和酸类化合物，如3-戊酮、2-甲基环戊烯-1-酮、苯乙烯、2H-吡喃-二酮、3-羟基-2-甲基-2-环戊烯-1-酮、苯乙酸苯乙酯、棕榈酸、硬脂酸等。酮类、醛类、烯类和酯类化合物一般具有甜香、果香,在卷烟中有醇和烟气口感的作用;羧酸类可以调节卷烟烟气pH,减少卷烟刺激性。这类物质也是烟草和烟气中常见的种类[12,44-45],能为丰富卷烟香气起到积极的贡献。

酚类物质，如苯酚、邻甲酚、对甲苯酚、对乙基苯酚等。酚类化合物可以产生酚样和药草香气,也是烟草和烟气中的常见物质[46]。

苯类物质，如苯、甲苯、联苯、2-甲基苯并呋喃、萘等。在高温燃烧区由于处于缺氧状态,有机物无法直接燃烧而发生聚合反应和自由基反应,形成稳定性好的苯及同系物、稠环化合物,同时也形成一些杂环的芳香族化合物[47]。

3 结论

由实验室制备得到的三个香加皮精多糖具有相似的单糖组成,而其组分含量的不同则影响了热稳定性链接结构,是造成热分析结果有差别的原因。通过对三种多糖的热重分析发现,三种多糖均在第三阶段大量分解,CPP1在第三阶段520 ℃结束后,失重率可以达到95%。CPP2在第三阶段550 ℃结束后,失重率达到88%。CPP3在560 ℃失重率达到86%。三个多糖的分解温度均低于烟支燃烧的热解区温度的400～700 ℃,处于蒸馏区温度范围内,说明香加皮多糖适合用作卷烟加香材料。对三种多糖的热裂解产物研究发现,600和900 ℃时会产生大量对烟草香味有贡献的热解产物,说明多糖在卷烟燃吸中能够起到增香补香的效果。