复合菌发酵米乳饮料的配方优化及其储藏品质变化

,,,*,, ,思明,,

(1.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070；2.中南林业科技大学稻谷及副产物深加工国家工程实验室,湖南长沙 410004)

米乳饮料是一种以大米、碎米或米粉为主要原料,辅以奶粉或一些其它营养物质,研制的一种健康的谷物饮料[1]。根据生产工艺,可分为非发酵型和发酵型两种。经乳酸菌发酵的米乳饮料不仅可以提高米乳的营养价值、降低机体胆固醇[2-3],还可抑制有害微生物的生长、赋予米乳独特的发酵风味[4-5]。

近年来,国内外学者对发酵米乳饮料的发酵与营养特性、配方优化等方面进行了一系列研究,结果表明,在米乳发酵过程中,菌种将直接决定着产品品质,不同菌种相互作用,能制成不同风味的米乳饮料。陈妍婕等、朱力杰等[6-7]研究了乳酸菌在发芽糙米乳中的发酵特性,从而筛选出了适合发酵发芽糙米乳的最佳菌株组合。陈海旭[8]研究发现,复合菌发酵优于单菌,不仅可弥补单菌发酵带来的风味单一缺陷,而且米乳的酸度、活菌数等指标更加均衡。闫祯等[9]、邹秀荣等[10]对乳酸菌米乳饮料的工艺进行了优化,研发出了多种风味独特的米乳饮料。目前,研究较多的是植物乳发酵剂在米乳中的发酵特性,而关于动物乳发酵剂与植物乳发酵剂复配的研究较少。

因此,本研究通过比较商用酸奶发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的复配冻干菌粉)和实验室自行从传统米浆中分离的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZSM-002[11]在米乳中的发酵特性,选择适宜复合菌,进而研制出一种口感黏稠、风味柔和的米乳饮料,为乳酸菌米乳饮料的进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米粉 湖北黄冈东坡粮油集团有限公司;脱脂乳粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司;MRS肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司;商用酸奶发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌复配冻干菌粉,以下简称H) 北京川秀生物科技有限公司;植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZSM-002(专利号:ZL2009100638581,以下简称Z) 华中农业大学食品科技学院食品大分子结构与功能特性实验室保藏;海藻酸丙二醇酯 食品级,河南万邦实业有限公司;蔗糖脂肪酸酯 食品级,河南圣德斯实业有限公司;果胶 食品级,河南三化生物科技有限公司;黄原胶 食品级,山东阜丰发酵有限公司。

ZM-100全自动反压高温蒸煮锅 广州标际包装设备有限公司;HD-1360水平流超净工作台 哈尔滨东联仪器公司;TDL-S-A台式离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;LRH-150B生化培养箱 广东省医疗器械;722S可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米乳饮料的制作 图1为米乳饮料的制作工艺流程。

图1 米乳饮料的制作工艺流程Fig.1 Production process of rice milk

混合米浆:称取一定量米粉,按照一定的米水比加水调浆,将脱脂乳粉加水调配成10%的脱脂乳液,然后将脱脂乳液按一定比例加入米浆中,并添加5%葡萄糖和一定量白砂糖,搅拌均匀,得到混合米浆。

糊化:将混合米浆置于沸水浴中糊化30 min,不断搅拌,防止糊化不均匀。

冷却:将糊化后的混合米浆迅速冷却至40 ℃以下。

接种发酵:向冷却后的混合米浆中接种一定量发酵菌种,置于一定的恒温条件下发酵一定时间。

稳定剂:在稳定剂的添加量为0.2%的前提下,研究海藻酸丙二醇酯、蔗糖脂肪酸酯、果胶、黄原胶4种稳定剂的最佳配比。

储藏:将发酵米乳饮料于4 ℃条件下储藏9 d,分别在第1、3、5、7、9 d取样测定其品质。

1.2.2 适宜复合菌株的确定 结合前期预实验效果,按照米水比1∶15 (g/mL),葡萄糖添加量5%,脱脂乳添加量5%配制基础米浆培养基,分别接种5%商用酸奶发酵剂,5%植物乳杆菌ZSM-002,5%复合菌种(商用酸奶发酵剂与植物乳杆菌ZSM-002的复配比分别为1∶1、1∶2、2∶1、3∶2、2∶3),于37 ℃发酵12 h,测定样品的滴定酸度。基于产酸曲线选出乳酸积累量最多的复配菌种,再通过活菌数、粗蛋白、可溶性蛋白及还原糖的含量分析,进一步确定适宜发酵复合菌。

1.2.3 发酵米乳饮料的配方优化

1.2.3.1 单因素实验 分别研究米水比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、脱脂乳加量(0%、5%、10%、15%、20%、25%)、白砂糖加量(0%、3%、5%、7%、9%、11%)、菌接种量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)、发酵时间(8、10、12、14、16、20、24 h)、发酵温度(35、37、39、41、43 ℃)对发酵米乳滴定酸度、活菌数、感官评定的影响,其中,各添加量按其占米浆重量的百分比计。试验过程中的不变水平值为米水比1∶15 (g/mL),脱脂乳15%,白砂糖9%,接种5%的复配菌种,稳定剂0.2%,37 ℃发酵12 h。

1.2.3.2 正交试验 根据上述试验结果,以脱脂乳添加量、发酵时间、发酵温度、菌接种量为考察因素,各选择3个水平,以滴定酸度、活菌数、感官评定为评价指标设计L9(34)正交试验(表1),确定发酵米乳饮料最佳制备条件。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.4 指标的测定及感官评价标准滴定酸度的测定 参照GB 541334-2010《乳和乳制品酸度的测定》。乳酸菌活菌数的测定:参照GB 4789.35-2010 《食品安全国家标准乳酸菌检验》,采用平板计数法测定。粗蛋白含量的测定:参考GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》,采用凯氏定氮法。可溶性蛋白含量的测定:采用Folin-酚试剂法进行测定。还原糖含量的测定:DNS法。

感官评价:由接受过专业培训的5人对米乳饮料的色泽、气味、口感、组织状态等指标进行分析,评分标准见表2。

表2 米乳饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation of rice milk

1.2.5 稳定剂的确定 以离心沉淀率为指标,在稳定剂的添加量为0.2%的前提下,选取海藻酸丙二醇酯、蔗糖脂肪酸酯、果胶、黄原胶四种稳定剂,设计4因素5水平均匀试验,研究米乳饮料的稳定性,确定4种稳定剂的添加比例。

稳定性测定:在有刻度的离心管里,准确加入米乳饮料10 mL,室温下3500 r/min离心15 min,除去上层清液,准确称量沉淀物质量,计算沉淀率[12]。离心沉淀率(%)=沉淀物质量×100/10 mL米乳饮料重量。

1.2.6 储藏品质研究 将最佳条件制作的米乳于4 ℃冷藏条件下储藏,每隔48 h取一次样,测定米乳的滴定酸度、活菌数,并对米乳进行感官评价,研究米乳的储藏品质。

1.3 数据处理

实验指标均进行2次重复,每次重复进行3次平行,采用SAS 9.2和origin 8.6对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 适宜复合菌株的确定

不同菌种在脱脂乳米浆培养基中产酸曲线如图2所示。由于脱脂乳米浆培养基中含有糖类、蛋白质等营养物质,所以随着发酵时间的延长,各组米浆培养基的滴定酸度均呈上升趋势,各菌株产酸量均不断增加。就单菌株来看,ZSM-002产酸量增加较快,最终的产酸量较高。将商用酸奶发酵剂、ZSM-002以不同比例进行复配,发现两者配比为3∶2时,其产酸速率、最终的产酸量最高,说明两株菌之间存在一定的共生关系,且此种比例下,两株菌的共生现象最明显,更有利于产品风味品质的形成。

图2 菌种的产酸曲线Fig.2 Acid production curves of bacteria注:H代表商用酸奶发酵剂,Z代表植物乳杆菌ZSM-002,H∶Z或H+Z代表复配菌(商用酸奶发酵剂与植物乳杆菌ZSM-002)；表3同。

不同菌发酵米乳的各项指标测定结果如表3所示。不同菌发酵米乳的滴定酸度、活菌数、粗蛋白、可溶性蛋白、还原糖含量均有显著性差异(p<0.05)。复合菌发酵米乳的滴定酸度远高于单菌发酵。ZSM-002发酵米乳的活菌数最高,复合菌发酵米乳的活菌数较商用酸奶发酵剂有明显升高。商用酸奶发酵剂发酵米乳的粗蛋白含量高于ZSM-002和复合菌,粗蛋白含量的增加,并不全是蛋白质的增加引起的,还可能是微生物产生的蛋白质类代谢产物,同时菌体本身也是一种蛋白质,发酵过程中大量增殖,从而增加了米乳中的蛋白质含量[8]。ZSM-002和复合菌发酵米乳的可溶性蛋白含量较商用酸奶发酵剂有明显升高。商用酸奶发酵剂发酵米乳的还原糖含量较ZSM-002、复合菌发酵米乳有所提高。因此,商用酸奶发酵剂与ZSM-002以3∶2的比例复配后发酵效果最好。

表3 发酵米乳的指标测定结果Table 3 Results of index determination of fermented rice milk

2.2 发酵米乳饮料的配方优化结果

2.2.1 单因素实验结果

2.2.1.1 脱脂乳添加量对米乳饮料品质的影响 脱脂乳添加量对米乳饮料滴定酸度、活菌数和感官品质的影响如图3所示。脱脂乳的添加量对其均有显著影响(p<0.05)。随着脱脂乳添加量的增多,米乳的酸度呈上升趋势。活菌数则是先上升后下降,当脱脂乳添加量为15%时,活菌数最高。脱脂乳能提高米乳感官品质,当脱脂乳添加量高于5%时,感官评分无明显变化,添加脱脂乳虽然能为乳酸菌提供生长繁殖所需的营养物质,但添加量过多时,会掩盖米乳本身的米香味,同时也会提高成本[13]。

图3 脱脂乳添加量对米乳饮料品质的影响Fig.3 Effects of degreased milk on the quality of rice milk注:不同的字母表示指标不同时,米乳的滴定酸度、活菌数、感官评分均具有显著性差异,p<0.05，图4～图9同。

2.2.1.2 白砂糖添加量对米乳饮料品质的影响 白砂糖添加量对米乳饮料滴定酸度、活菌数和感官品质的影响如图4所示。随着白砂糖加量增加,米乳酸度、活菌数均呈先上升后下降趋势。当白砂糖添加量为3%时,米乳酸度、活菌数最高。感官评分随白砂糖加量的增加逐渐升高,当白砂糖加量为9%时,感官评分最高。考虑到产品接受度主要受感官评价影响,故选择感官评分最高组(9%白砂糖添加量)进行后续配方优化实验。

图4 白砂糖添加量对米乳饮料品质的影响Fig.4 Effects of sugar content on the quality of rice milk

2.2.1.3 菌接种量对米乳饮料品质的影响 菌接种量对米乳饮料滴定酸度、活菌数和感官品质的影响如图5所示。随着菌接种量的增加,米乳酸度、活菌数均呈先上升后无明显变化,当接种量大于3%时,酸度变化不再显著(p>0.05)。当接种量大于4%时,活菌数变化不再显著(p>0.05)。感官评分随菌接种量的增加逐渐升高,当接种量为5%时,综合评分最高。

图5 菌接种量对米乳饮料品质的影响Fig.5 Effects of inoculation amount on the quality of rice milk

2.2.1.4 发酵时间对米乳饮料品质的影响 发酵时间对米乳饮料滴定酸度、活菌数和感官品质的影响如图6所示。随发酵时间的延长,米乳的酸度呈上升趋势,活菌数、感官评分均先升高后下降,12 h时达到最高。这是由于随着发酵时间的延长,米浆中营养物质减少、环境劣化,从而导致部分菌体死亡,活菌数下降[14],同时,发酵时间过长也会对米乳的感官品质有所影响。

图6 发酵时间对米乳饮料品质的影响Fig.6 Effects of fermentation time on the quality of rice milk

2.2.1.5 发酵温度对米乳饮料品质的影响 发酵温度对米乳滴定酸度、活菌数和感官品质的影响如图7所示,发酵温度对其均有显著影响(p<0.05)。随发酵温度的升高,米乳酸度呈上升趋势,后趋于稳定,活菌数和感官评分均呈下降趋势,在35、37 ℃时,两者均较高。

图7 发酵温度对米乳饮料品质的影响Fig.7 Effects of fermentation temperature on the quality of rice milk

2.2.1.6 米水比对米乳饮料品质的影响 米水比对米乳滴定酸度、活菌数和感官品质的影响如图8所示。随着米水比的增加,米乳酸度逐渐下降,活菌数逐渐升高,综合评分先升高后下降,综合考虑,选择米水比为1∶10 (g/mL)时较为合理。

图8 米水比对米乳饮料品质的影响Fig.8 Effects of feed water on the quality of rice milk

2.2.2 正交试验结果 以发酵时间、发酵温度、菌接种量、脱脂乳添加量4个因素设计正交实验L9(34),综合考察发酵米乳的滴定酸度、活菌数和感官品质,相对于滴定酸度,活菌数和感官品质对于产品的接受度更为重要,因此选择活菌数和感官品质为主要指标,在活菌数和感官评分较高的情况下,综合考虑米乳的滴定酸度,从而优化发酵米乳最佳制备条件,实验结果如表4所示。

表4 正交试验结果Table 4 The results of orthogonal test

对于A(发酵时间)因素,活菌数和感官评分都是取A1较好,且对于活菌数,A因素是最主要的因素,在确定优水平时应重点考虑;对于滴定酸度,A是影响最小的因素,综合考虑选取A1。对于B(发酵温度)因素,3个指标都取B2,因此,B2是较适宜的水平。对于C(菌接种量)因素,活菌数取C1,感官评分取C2,滴定酸度取C3,且C因素对活菌数的影响最大,且从K1、K2、K3看C值相差不大,因此综合考虑选取C1。对于D(脱脂乳添加量)因素,重点考虑的活菌数和感官评分都取D2,滴定酸度取D3,且从K1、K2、K3看D值相差不大,因此综合考虑选取D2。

对实验结果进行方差分析可知(表5):4因素对滴定酸度均有极显著性影响(p<0.01);发酵时间、发酵温度、菌接种量对活菌数有极显著性影响(p<0.01),脱脂乳添加量对活菌数有显著性影响(p<0.05);发酵时间、发酵温度、脱脂乳添加量对感官有极显著性影响(p<0.01),菌接种量对感官有显著性影响(p<0.05)。综合上述,最优组合为A1B2C1D2,即最佳品质制备条件为发酵时间10 h,发酵温度37 ℃,菌接种量3%,脱脂乳添加量为10%,于优化条件下进行重复验证实验,测得滴定酸度为(17.03±0.92) °T,活菌数为(8.53±0.08)lg (cfu/mL),感官评分为(8.83±0.20)分。

表5 正交试验方差分析表(F/P)Table 5 Analysis of variance for orthogonal test(F/P)

2.3 米乳的稳定性研究

复合稳定剂均匀设计结果如表6所示。对结果进行分析,得到米乳复合稳定剂配方模型:

表6 稳定剂复配均匀设计结果Table 6 Results of uniform design of stabilizer compounding

Y=238.3X2-28.18X1-56.52X3+253.9X4-2.10X1X2+1.68X1X3-2.32X1X4-1.68X2X3-9.84X2X4-1.92X3X4(R2=0.9977,F=436.46,p=0.000)

在回归模型的基础上,为得到最优配方比例,根据约束条件进行求解。

经软件(SAS 9.2)数据分析得知,当海藻酸丙二醇酯、蔗糖脂肪酸酯、果胶、黄原胶比例分别为60.0%、0.2%、38.0%、1.8%时,米乳的离心沉淀率为2.02%。据此配比制备米乳,测定离心沉淀率为2.25%,与理论计算值较接近,表明该配比适宜。

2.4 米乳饮料的储藏品质

米乳饮料在4 ℃储藏过程中滴定酸度和活菌数的变化情况如图9所示,随储藏时间延长,米乳的滴定酸度呈上升趋势,储藏3 d时,米乳的滴定酸度无显著变化(p>0.05),7 d后达到最高值(34.21 °T);活菌数呈先上升后下降趋势,储藏9 d时,米乳的活菌数显著下降(p<0.05)。

图9 4 ℃储藏过程中米乳的品质变化Fig.9 Quality changes of rice milk at 4 ℃storage conditions

米乳饮料在4 ℃储藏过程的感官评价如表7所示,储藏5 d时,口感略酸;储藏7 d时,米乳的口感偏酸,虽有少许上清液析出,但整体体系感官接受度较高;储藏9 d时,米乳的酸味略重,且分层现象严重,感官接受度较低。因此,米乳于4 ℃条件储藏7 d可保持相对较好感官品质。

表7 4 ℃条件储藏过程中米乳饮料的感官评价Table 7 The sensory quality of rice milk at 4 ℃

3 结论

本实验通过研究商用酸奶发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZSM-002在米乳中的发酵特性,确定将商用酸奶发酵剂和植物乳杆菌ZSM-002以3∶2复配作为米乳发酵的菌种,优化的米乳饮料配方为:米水比1∶10 (g/mL)、3%的复合菌接种量、10%脱脂乳、9%白砂糖、0.2%复合稳定剂(海藻酸丙二醇酯60%,蔗糖脂肪酸酯0.2%,果胶38%,黄原胶1.8%),37 ℃发酵10 h,此条件下制作的米乳饮料的滴定酸度为(17.03±0.92) °T,活菌数为(8.53±0.08)lg (cfu/mL),感官评分为(8.83±0.20)分,离心沉淀率为2.25%;在4 ℃条件下储藏7 d后,其酸度为(34.2±1.56) °T,活菌数为(7.44±0.12)lg (cfu/mL),仍可保持相对较好的感官品质。