可手术胃癌和结直肠癌中血清TK1和Hepcidin表达及其与临床病理特征的关系

程 旭 陆 晔 仇慧珠 潘湘涛

细胞质胸苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)与细胞的增殖有关，在DNA的合成中将胸腺嘧啶核苷转换为单磷酸胸腺嘧啶，是嘧啶补救合成途径中的关键调节酶[1-2]。近期有研究表明肿瘤细胞中高水平的TK1可以从细胞周期中的S期一直持续到M期，TK1的表达水平与DNA的合成具有一致性，在增殖细胞中水平升高[3]，提示TK1的表达水平可以作为肿瘤细胞生长、增殖的1种标志物。我们既往的研究[4]表明Hepcidin是引起肿瘤等疾病中慢性病贫血的主要原因，并且在肿瘤组织中也有表达、并与T分期等有关[5]。因此，本研究应用化学发光法检测66例可手术的胃肠道肿瘤患者的血清TK1表达情况，同时应用免疫组化方法检测肿瘤组织中Hepcidin表达，以探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收治本院2016年1月至2017年9月期间手术切除的资料较为完整的66例患者，其中胃癌29例、结直肠癌37例。对其存档蜡块，均经病理学检查复查确诊明确无误，并且术前均未经化疗或放疗。其中男性40例，女性26例，年龄23～82岁、中位年龄64岁。TNM分期符合全国胃癌协作组病理组规定标准。本组无远处转移等晚期肿瘤病例。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化实验 试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。采用SABC免疫组织化学染色法，所有石蜡标本均进行5 μm切片，连续切4张，置于600烤箱内烤30 min；均分别予二甲苯脱蜡、无水酒精及其他不同浓度酒精脱蜡，自来水洗2 min水化。一张切片进行HE染色复核病理诊断、其余四张SABC染色，按试剂盒的操作规程进行。以PBS代替一抗做阴性对照。结果判断以细胞质和细胞浆被染成棕黄色或黄褐色为阳性。 高倍镜下随机选取5个视野，按照瘤细胞着色的深度计分,染色强度浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。按照阳性细胞数记分,阳性细胞数<10%为0分;11%～25%为1分,26%～50%为2分;51%～75%为3分,75%以上为4分。两个分值相乘,0分为阴性,记为(-)；1～4分为弱阳性,记为(+);5～8分为中度阳性(++),≥8分为强阳性(+++)。

1.2.2 血清TK1测定 ①TK1试剂盒、GIS-1型化学发光数字成像分析仪均购自华瑞同康生物技术(深圳)有限公司。所有研究工作均在本院肿瘤科实验室完成。患者空腹抽血5 ml，30 min内高速离心，取血清备用。制备抗体稀释液、洗液、封闭液。将内含硝酸纤维素膜的膜板平放在一张干净的滤纸上，不同浓度的标准品按1号、2号、3号的顺序点样到A1、A2、A3位置上，每孔3 μl；待测血清按每孔3 μl顺序点后面的膜上，室温下自然晾干。打开膜板，将膜放入反应盒内，用配置后的稀释液振摇洗膜2次，每次5 min。弃去洗涤液，加封闭液，室温下振摇封闭1 h。加一抗(TK1-IgY)，40 ℃下过夜。弃去反应液，用洗液漂洗3次后，振摇洗涤3次，每次5 min。加二抗(生物素化抗IgY二抗)，室温下振摇反应40 min，弃去反应液，用洗液漂洗3次后，振摇洗涤3次，每次5 min。加链酶亲和素-酶复合物，室温下振摇反应1 h。弃去封闭液，用洗液漂洗3次后，振摇洗涤3次，每次5 min。加ECL发光试剂，过膜浸湿，精确反应1 min。将膜放入CIS-1型化学发光成像分析系统内进行分析。上述重复3次。取3次测量值均数，测量值波动范围为均数±0.5 mg。②依据既往的大样本临床试验研究数据确定的血清TK1的参考值，即血清TK1水平0～2.0 pmol/l为正常，>2.0 pmol/l为异常[6]。

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件，根据资料性质应用卡方检验，t检验，以及Spearman进行等级相关分析。

2 结果

2.1 胃肠道肿瘤组织中Hepcidin表达情况

Hepcidin在癌旁正常胃黏膜组织中阳性表达率为20.0%(3/15)，胃肠道肿瘤组织中其阳性表达率为62.1%(41/66)，差异具有显著性(χ2=8.74，P<0.01)。Hepcidin表达与年龄、T分期和脉管浸润有关(P<0.05，0.01和0.01)，而与性别、有无淋巴结转移、分化程度、Her-2表达和有无贫血均无相关性(P均>0.05)。具体结果见表1。

2.2 术前血清TK1表达与其临床病理特点的关系

总阳性表达6例，阳性率9.09%。其中37例肠癌患者TK1阳性3例、阴性34例，而29例胃癌患者TK1阳性3例、阴性26例，两者之间无统计学意义(χ2=0.10，P>0.05)。考虑到胃癌和肠癌两者之间TK1的表达无明显差异，同时鉴于本组资料相对偏少，因此将两者合并后再进一步进行统计学分析。研究结果表明血清TK1的表达水平与患者性别、分化程度、Her-2表达有关，而与年龄、T分期、脉管浸润、淋巴结转移、有无贫血之间均无相关性。胃癌、结直肠癌患者血清TK1表达与其临床特征的关系见表1。

2.3 Hepcidin表达与血清TK1与Ki-67、Hb水平关系

肿瘤组织中Hepcidin表达与血清TK1与Ki-67、Hb水平的关系见表2。肿瘤组织中Hepcidin表达与Ki-67是相关的，而与Hb水平无相关关系；同样血清TK1表达与Ki-67相关，而与Hb水平无相关关系。

表1 肿瘤组织中Hepcidin和血清TK1表达与其临床特征的关系

注:*为P<0.05,**为P<0.01,余均为P>0.05。

表2 肿瘤组织中Hepcidin和血清TK1表达与Ki-67、Hb水平的关系

注:*为P<0.05,**为P<0.01,余均为P>0.05。

将肿瘤组织Hepcidin的表达与血清中TK1表达进行相关分析，结果提示肿瘤组织Hepcidin的表达与血清中TK1表达两者之间并无直接的相关关系，γ=-0.1005，P>0.05。

3 讨论

我们的研究结果表明肿瘤组织中高表达Hepcidin，并且两者均与患者的年龄、T分期、Ki-67水平和脉管浸润相关；但与患者的性别、有无淋巴结转移、分化程度、Her-2表达和有无贫血均无相关关系。这与文献结果基本一致，如Ward等[7]的研究表明肠癌患者高表达Hepcidin；Kamai等[8]的研究提示肾癌患者肿瘤组织中hepcidin mRNA的表达可能与组织分化及肿瘤的分期无关。Pinnix等[9]的研究则表明乳腺癌患者高表达Hepcidin mRNA。因此，结合本研究结果和文献结果可以认为在胃肠道肿瘤组织中Hepcidin的表达和肿瘤的局部浸润有关。上述结果与我们既往的研究结果是一致的[5]。但由于本研究中无远处转移等晚期病例，对于该类患者的情况有待于进行进一步深入研究。

近期有研究[10-11]表明食道癌、胃癌、结直肠癌等患者的血清TK1的阳性率明显高于正常对照组[13]，并且TK1在多种恶性肿瘤中表达上调，预示着预后不良[12]。表明TK1能够表示肿瘤细胞的增殖程度、因而可以判断肿瘤的恶性程度，进而可以判断肿瘤的治疗效果和预后。本文TK1阳性率为9.09%(6/66)，低于霍颖等[13]TK1在结肠癌中的阳性率59.21%，我们分析认为本研究中均是能够可以手术的病例，没有转移等Ⅳ期晚期患者，可能影响了TK1的阳性率。同时我们也发现TK1表达与患者的T分期、淋巴结转移、分化程度等均无相关关系，与刘昕等[14]TK1在胃癌、结肠癌和肺癌等中随着分期有增高趋势不相一致，与黄志宇等[12]在晚期非小细胞肺癌中与淋巴结转移无关的结果一致、但与其TMN分期有关的结果不一致。我们分析产生上述差异的原因是在于选择的病种及其病情程度(即分期等)有关不完全相同有关，比如刘昕等[14]文章中包含了肺癌等病例，而黄志宇等[12]基本为晚期病例，他们应用的是TMN分期，包括了很多有转移在内的Ⅳ期患者，而我们的研究中都为能够手术的病例、无晚期病例，并且我们应用的T分期。当然也不排除我们的病例数不太多也有影响，对于确切的原因，有待于进一步深入研究。另外，TK1的表达与患者的性别、Her-2的表达和Ki-67的水平相关，至今有关这方面的报道尚不多见。目前较多的意见认为Her-2是胃癌的独立的不良预后因素，虽然在肠癌中的研究略少，但基本的研究结果与在胃癌中的结果是相似的。Ki-67则是1个普遍认为的恶性肿瘤患者的恶性程度及预后的指标，即Ki-67越高则恶性程度越高、预后越差。因此，我们认为本研究中TK1的表达结果与Her-2、Ki-67表达的结果是一致而并不矛盾的的。

我们发现患者肿瘤组织中的Hepcidin表达与血清中的TK1水平不相关(γ=-0.1005，P>0.05)。但是肿瘤组织中的Hepcidin表达与年龄、T分期、脉管浸润和Ki-67相关，而血清TK1则与性别、Her-2表达，分化程度和Ki-67相关。两者之间的关系正好是互补关系，提示联合检测肿瘤组织中的Hepcidin表达与血清中的TK1的水平，可以更好地判断患者的病情恶性程度、判断预后，从而指导临床更合理地选择治疗方案以取得较好的治疗效果。

总之，对于可手术的胃癌和结直肠癌患者联合检测肿瘤组织中的Hepcidin表达与血清中的TK1的水平是有一定意义的，值得进一步深入研究、进一步探索。