纳豆菌拮抗黄曲霉试验方法的研究

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(福建农业职业技术学院，福州 350119)

黄曲霉容易产生黄曲霉毒素，该毒素是一种有剧毒和强致癌物质，为迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种。黄曲霉毒素最易污染玉米、花生、花生油、大米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯[1]。黄曲霉毒素的裂解温度为280 ℃，一般烹调加工温度不足以将其破坏，而且在水中溶解[2]。因为玉米等粮食霉变而引起的动物饲料霉变而产生毒素，引起畜产品毒素超标[3]。因此，对黄曲霉毒素的控制重在避免食物或畜禽饲料污染黄曲霉而发生霉变。

近年来，对纳豆菌产生的抑菌物质的研究较多[4-12]。一般的研究方法主要是得到液体培养的细菌离心上清液，然后对其抑菌特性进行考察，比较常用的方法主要是滤纸片法、牛津杯法等，但是，对于考察抑菌性能的试验来说，这些方法显得有些繁琐，而且真正需要通过这些试验方法得到试验结果时，经常碰到试验结果不稳定的情况。因此，探索稳定、简便的试验方法具有重要意义。

本研究考察了纳豆菌对常见的污染食品的黄曲霉的拮抗作用，并探讨了方便、稳定、操作性强的细菌抑制霉菌的试验方法，旨在为天然防腐剂的研究及开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料

纳豆菌、黄曲霉：由福建农业职业技术学院微生物实训室提供；土豆、牙签：市售。

1.1.2 试剂

琼脂：BR生物试剂，杭州百思生物技术有限公司；葡萄糖：分析纯，西陇化工股份有限公司。

1.1.3 仪器

DNP-9272BS-Ⅲ型电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；HZ-HG-502N型电子天平 福州衡之展电子有限公司；LDZX-40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HH-4型恒温水浴锅 常州市凯航仪器有限公司。

1.1.4 培养基配方及配制方法[13]

1.1.4.1 马铃薯葡萄糖培养基配方

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1000 mL，pH值自然。

1.1.4.2 马铃薯葡萄糖培养基的配制方法

将马铃薯去皮，切成0.5 cm3的小块，放入1000 mL水中，煮沸20～30 min，然后用4层纱布过滤得滤液，加入葡萄糖溶解后加入琼脂煮沸，补充水至1000 mL，灭菌条件：121 ℃蒸汽灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 滤纸片法

将溶化的PDA培养基15～20 mL倒入无菌培养皿中制成平板，将活化2次的黄曲霉，用9 mL无菌生理盐水，加入2环黄曲霉孢子，混匀待用；用无菌吸管取黄曲霉孢子悬液0.2 mL涂布平板；纳豆菌用接种环挑取1环加入9 mL无菌生理盐水混匀，将灭过菌的直径为1 cm的圆形滤纸片蘸取已经制备好的纳豆菌液，并在试管壁上稍停靠，勿使滤纸上有过多菌悬液，贴在涂布黄曲霉24 h的平板上，每个滤纸片之间、滤纸片和培养皿边缘之间间隔1 cm。

1.2.2 点值法

将溶化的PDA培养基15～20 mL倒入无菌培养皿中制成平板，将活化2次的黄曲霉，用9 mL无菌生理盐水，加入2环黄曲霉孢子，混匀待用；用无菌吸管取黄曲霉孢子悬液0.2 mL涂布平板；纳豆菌用灭菌牙签蘸取平板上的纳豆菌1次，在涂布黄曲霉的平板上连续点种4次，接种点之间和培养皿边缘要间隔1 cm以上。

1.2.3 抑菌圈大小的测量方法

抑菌圈外边缘直径-纳豆菌外边缘直径=抑菌圈的大小。

2 结果与分析

2.1 滤纸片法

2.1.1 涂布黄曲霉后直接贴纳豆菌悬液滤纸片

涂布黄曲霉孢子悬液后，直接贴纳豆菌悬液滤纸片，纳豆菌迅速长满整个平板，抑制黄曲霉生长，导致黄曲霉无法萌发生长，结果见图1。

图1 涂布黄曲霉后0 h接种纳豆菌的生长情况Fig.1 Growth of Bacillus natto after coating Aspergillus flavus for 0 hour

由图1可知，涂布黄曲霉孢子悬液和粘贴纳豆菌悬液的滤纸片同时进行，这种方法无法得到预想的结果。原因主要是平板中涂布黄曲霉孢子悬液后，培养基表面有较多水，蘸取纳豆菌悬液的滤纸片在培养基表面容易滑动，同时纳豆菌有鞭毛，会运动，特别是培养基表面有水，更有助于纳豆菌的运动，同时纳豆菌的生长繁殖速度比黄曲霉孢子萌发和生长速度快，加上纳豆菌对黄曲霉有抑制作用，所以会出现纳豆菌铺满整个平板而黄曲霉不长的现象，由此可知该方法不可行。

2.1.2 涂布黄曲霉24 h贴纳豆菌悬液滤纸片

涂布黄曲霉孢子悬液24 h，于长有黄曲霉的平板表面贴纳豆菌悬液的滤纸片，滤纸片贴好后正置培养24 h观察结果，见图2。

图2 纳豆菌生长24 h的拮抗情况Fig.2 Antagonistic effect of Bacillus natto growing for 24 h

由图2可知，黄曲霉孢子萌发，同时纳豆菌产生明显的抑菌圈。进一步培养，纳豆菌接种72 h后，二者的拮抗情况见图3。

由图3可知，没有纳豆菌抑菌物质的地方，黄曲霉铺满整个平板并形成大量孢子，纳豆菌的抑菌圈更加明显而且抑菌物质效果稳定。由此可知，黄曲霉孢子悬液涂布平板后，28 ℃正置培养24 h，表面的水分充分蒸发，平面上没有冷凝水，而且黄曲霉孢子已经萌发，这时蘸取纳豆菌菌悬液的滤纸片贴在平面上，纳豆菌的运动受到限制，只能在固定的区域生长繁殖，纳豆菌生长过程中产生抑菌物质，在菌生长的地方和一定范围内抑制黄曲霉的生长，产生明显的抑菌圈。因此，该方法进行拮抗试验是可行的。

图3 纳豆菌生长72 h的拮抗情况Fig.3 Antagonistic effect of Bacillus natto growing for 72 h

2.1.3 涂布黄曲霉48 h贴纳豆菌悬液滤纸片

涂布黄曲霉孢子悬液48 h，于长有黄曲霉的平板表面贴纳豆菌悬液的滤纸片，培养24 h后观察结果，见图4。

图4 纳豆菌生长24 h的情况Fig.4 The situation of Bacillus natto growing for 24 h

由图4可知，黄曲霉接种48 h，黄曲霉菌丝已经长出，铺满整个平板，这时将蘸取纳豆菌悬液的滤纸片贴上去，纸片不能直接和培养基接触，而且黄曲霉生长已经占有优势，纳豆菌接触不到培养基，无法生长，所以无法产生抑菌现象。

2.2 点值法

涂布黄曲霉孢子悬液后，直接贴纳豆菌悬液滤纸片，纳豆菌迅速长满整个平板，抑制黄曲霉生长，导致黄曲霉无法萌发生长，无法得到预想的试验结果，因此此方法不可行。

根据滤纸片法的试验经验，点值法的试验方法根据2.2进行，倾倒PDA培养基15～20 mL，凝固形成平面，涂布黄曲霉孢子悬液0.2 mL，28 ℃正置培养24 h，用灭菌牙签直接挑取纳豆菌，在平板上点植，每个接种点之间、接种点和平皿边缘分别间隔1 cm，28 ℃正置培养24 h，此时2种菌都能生长，但是纳豆菌周围抑菌圈不明显，结果见图5和图6。

图5 正面生长情况(黄曲霉48 h，纳豆菌24 h)Fig.5 The frontal growth situation (Aspergillus flavusgrows for 48 h, Bacillus natto grows for 24 h)

图6 背面生长情况(黄曲霉48 h，纳豆菌24 h)Fig.6 The back growth situation (Aspergillus flavus grows for 48 h, Bacillus natto grows for 24 h)

继续培养24 h观察发现，纳豆菌周围出现明显的抑菌圈，黄曲霉形成大量孢子，见图7和图8。

图5基本未出现抑菌圈，图7出现明显的抑菌圈，继续培养至纳豆菌生长60 h(见图9)的抑菌圈大小和图7基本一致，可以判断纳豆菌的抑菌物质是菌体生长到一定阶段或时间后形成的。因此，纳豆菌的抑菌能力与培养时间的长短有重要关系。

图7 正面生长情况(黄曲霉72 h，纳豆菌48 h)Fig.7 The frontal growth situation (Aspergillus flavus grows for 72 h, Bacillus natto grows for 48 h)

图8 背面生长情况(黄曲霉72 h，纳豆菌48 h)Fig.8 The back growth situation (Aspergillus flavus grows for 72 h, Bacillus natto grows for 48 h)

图9 正面生长情况(黄曲霉84 h，纳豆菌60 h)Fig.9 The frontal growth situation (Aspergillus flavus grows for 84 h, Bacillus natto grows for 60 h)

2.3 滤纸片法和点值法抑菌圈的对比

滤纸片法和点值法的抑菌圈大小不再发生变化时，分别测量菌落及其周围抑菌圈的垂直直径，并计算纳豆菌抑菌圈的大小，结果见表1。

表1 2种方法纳豆菌抑菌物质活性对比Table 1 Comparison of antimicrobial activity of Bacillus natto by two methods

注：φ表示菌落直径；σ表示抑菌圈直径；σ-φ表示抑菌圈大小。抑菌圈测试方法：先测菌落的直径，再测抑菌圈的直径。抑菌圈直径-菌落直径=抑菌圈大小，用抑菌圈的大小反映菌株分泌抑菌物质能力的大小。

由表1可知，单从菌落直径和抑菌圈直径来看，滤纸片法明显比点值法大，而且滤纸片的菌落直径和抑菌圈直径4平行数据比较均匀，而点值法的这些数据有些波动，但是滤纸片法和点值法的抑菌圈大小平均值分别为11.3 mm和11.0 mm，差异并不明显。2种方法均可行，通过多次试验发现，点值法较简单，重复性和稳定性更好。菌落直径和抑菌圈直径大小波动主要是点植时接菌量的多少造成的，从最后结果来看，通过重复试验求平均值的方法及控制点植时的接菌量就能获得波动较小的结果。

3 结论

先在平板上涂布黄曲霉孢子悬液，再接种纳豆菌，二者间隔时间不同，出现不同的拮抗效果。试验表明：最佳接种纳豆菌的时间为黄曲霉涂布平板后24 h左右，此时平板表面没有多余水分，纳豆菌虽然有鞭毛，但是在没有冷凝水的固体培养基表面运动受到限制，不容易出现片状生长，而且黄曲霉孢子已经萌发，2种菌能够同步生长，从而达到理想的拮抗效果。

滤纸片法因为用圆形滤纸片蘸取纳豆菌悬液，滤纸片上有大量水分，纳豆菌有鞭毛，能运动，生长繁殖快，操作需要丰富的经验，否则容易出现失败的结果。

点值法只需将纳豆菌活化，在平板上出现单菌落，用灭菌牙签蘸取纳豆菌点种在涂布黄曲霉孢子悬液正置培养24 h左右的平板上，该方法操作简单，容易成功。

以上2种方法进行抑菌效果的对比，虽然菌落和抑菌圈直径出现较大差异，但是对比抑菌圈大小，数据显示并无明显差异。因此，进行拮抗试验时选用点值法容易成功，简便易行，重复性和稳定性好，容易得到理想的结果。