EBV-BZLF1通过激活PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞生长

杨菁 李北芳 张朦琦 李艳艳 章程 高静

在中国，约70%胃癌患者在确诊时即处于局部进展期或发生远处转移，预后不良。确切的分子分型是进行精准治疗和改善预后的重要途径。2014年，癌症基因组图谱（TCGA）首次将胃癌从分子水平分为4种亚型，其中包括EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）阳性胃癌，也称为EBV相关性胃癌（EBV associated gastric cancer，EBVaGC）［1］。肿瘤组织EBER-ISH（原位杂交）阳性为诊断EBVaGC 的“金标准”。研究表明，在整个胃癌人群中约占8%～10%，因不同肿瘤分期、地域和种族而有所差别［2］。

EBV 也称为人疱疹病毒4（human herpes virus，HHV-4），是重要的DNA 肿瘤病毒，人群感染率高达90%。EBV 可长期在人体内维持潜伏感染，高表达EBV 编码的RNA（EBER）、EBV 核抗原（EBNAs）、潜伏膜蛋白（LMP）和病毒miRNA。当EBV病毒进入裂解复制期，即刻早期基因，如BZLF1 基因、早期和晚期基因活化，以合成子代病毒，最终导致宿主细胞死亡［3］。EBV病毒从潜伏期向裂解期的转变，是发展为EBVaGC 的关键过程［4］，BZLF1 则是启动裂解期的关键物质。在病毒复制早期，它能够促进P53蛋白结合靶基因启动子从而增强转录［5］。而当病毒复制进入中晚期，BZLF1 通过泛素化降解野生型P53 蛋白，干扰P53蛋白的抑癌作用［6］。

病毒感染引起的宿主细胞基因和表达的改变是致癌机制研究的热点，病毒产物与宿主的相互作用可影响肿瘤的发生发展和生物学特性［7-8］。因此，本研究旨在探讨BZLF1对胃癌细胞生物学行为的影响及可能的分子机制，为探索EBVaGC潜在治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和动物 人胃癌细胞系AGS和HGC27购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；5周龄雌性NOD/SCID小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。本研究经医院伦理委员会审查通过（批号：EAEC 2018-12）。

1.1.2 实验试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；CCK8 试剂盒购自日本同仁化学研究所；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国Biosciences公司；抗体PI3K、AKT、pAKT、ERK、pERK、S6、pS6、兔二抗和鼠二抗购自美国CST公司，β-actin 抗体购自美国Sigma 公司，BZLF1 抗体购自美国Santa Cruz 公司；化学发光试剂购自北京普利莱基因技术有限公司；BZLF1 和GAPDH 引物购自北京天一辉远公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 将带有GFP 荧光标记标签和嘌呤霉素筛选基因的BZLF1基因表达载体及其对照空白载体转染24 孔板中处于对数生长期的胃癌细胞，于48 h后药物筛选并消化、收集细胞。

1.2.2 聚合酶链式反应 提取细胞总RNA 后，通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）生成cDNA 模板。根据TaKaRa LA PCR kit试剂盒所提供的反应体系进行PCR检测，使用GAPDH基因作为内参。

1.2.3 CCK8检测细胞增殖 按照1×104个/孔将胃癌细胞培养于96 孔板中，孵育过夜。分别在细胞贴壁后0、12、24、48 h 换液，并于各副孔中加入10 µL CCK8 溶液，37℃孵育1 h 后分光光度仪读取450 nm处光密度（OD）值，重复3次实验。

1.2.4 CCK8检测细胞毒性 胃癌细胞以3 000个/孔培养于96孔板中，孵育过夜。观察细胞贴壁后，加入梯度浓度的BEZ235，孵育72 h。换液，并加入10µL CCK8 溶液，孵育2 h。使用分光光度仪读取450 nm处OD值，重复3次实验。

1.2.5 细胞凋亡检测 按照凋亡检测试剂盒使用说明向各组细胞中加入AnnexinV-FITC 和（或）PI 染色试剂，1 h内流式上机检测并分析凋亡比例。

1.2.6 细胞迁移和侵袭实验 用不含血清的Opti-MEM培养基重悬细胞至浓度为2×105个/mL，向24孔板中加入600 µL 含10%FBS 的培养基后放入无胶Transwell 小室，再往小室内加入200 µL 细胞悬液，24 h后固定并染色，显微镜下观察发生迁移的细胞数量，即表明细胞的迁移能力。放入带胶Transwell 小室即检测细胞的侵袭能力。

1.2.7 Western blot 法检测 将蛋白样品进行SDSPAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜，5%BSA室温封闭1 h 后使用推荐一抗浓度4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h后ECL发光显示结果。

1.2.8 细胞源性移植瘤（cell derived xenograft，CDX）的构建 取浓度为5×107个/mL的细胞悬液0.1 mL于皮下注射到小鼠的右侧背部。自注射起每4 天测量肿瘤体积和小鼠体质量。肿瘤体积：V=（L×W2）/2（V：肿瘤体积；L：肿瘤长度；W：肿瘤宽度）

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。χ2检验分析相关性，t或χ2检验分析组间差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒BZLF1基因表达载体的构建与鉴定

病毒BZLF1 基因表达载体的构建由北京Gene-Copoeia 公司完成，将BZLF1 基因编码区全长构建于LV201载体上产生。构建好的BZLF1表达载体转染入AGS和HGC27胃癌细胞48 h后采用嘌呤霉素进行筛选，荧光显微镜下观察细胞转染效率较高（绿色荧光细胞比例＞90%，图1A），收集细胞进行PCR和Western blot法实验，发现外源性BZLF1导入后，BZLF1表达明显上调（图1B，C），表明该载体可用于后续研究。

2.2 BZLF1对胃癌细胞生长的影响

体外细胞实验发现，与对照组相比（HGC27-Vector），AGS-BZLF1和HGC27-BZLF1胃癌细胞的增殖能力均有增强（图2A，B，C），体内动物实验也发现，HGC27-BZLF1细胞移植瘤的生长速度较HGC27-Vector组更快（图2D）。表明BZLF1基因可促进胃癌细胞生长。

2.3 BZLF1对胃癌细胞凋亡、迁移和侵袭能力的影响

进一步探索BZLF1对胃癌细胞生物学行为的影响，凋亡实验显示AGS-Vector 细胞凋亡比例为（5.75±0.35）%，而AGS-BZLF1细胞凋亡比例为（2.40±0.14）%；同样发现，HGC27-Vector及HGC27-BZLF1细胞的凋亡比例分别为（9.70±0.42）%和（3.90±0.14）%，BZLF1过表达组胃癌细胞凋亡减少（图3A，B）。但未发现两组细胞的迁移和侵袭能力存在显著性差异（图3C，D）。

图1 病毒BZLF1基因表达载体导入胃癌细胞后的鉴定

图2 BZLF1对胃癌细胞生长的影响

图3 BZLF1对胃癌细胞AGS及HGC27凋亡和侵袭转移的影响

2.4 BZLF1 对胃癌细胞PI3K/AKT 通路蛋白表达的影响

深入探索BZLF1 促进胃癌细胞生长的可能分子机制，发现相比于Vector 组，AGS-BZLF1 细胞中pS6蛋白表达上调；HGC27-BZLF1 细胞中也存在pAKT和pS6 蛋白表达上调（图4A）。另外，HGC27-BZLF1移植瘤组织中发现pAKT 和pS6 蛋白显著上调（图4B），表明BZLF1 可激活胃癌细胞PI3K/AKT 信号通路，并且可能通过激活该通路而促进胃癌细胞生长。

图4 Western blot法检测胃癌细胞PI3K/AKT信号通路的蛋白表达

2.5 PI3K通路抑制剂对BZLF1的促生长作用的影响

使用抑制剂BEZ235阻断PI3K信号通路后发现，AGS-BZLF1和HGC27-BZLF1胃癌细胞的增殖能力明显下降。且BEZ235所发挥的抑制作用呈剂量依赖性（图5）。该结果进一步验证BZLF1可能通过激活PI3K/AKT信号通路发挥促进胃癌细胞生长的作用。

图5 不同浓度BEZ235作用72 h后细胞活性变化的折线图

3 讨论

EBVaGC作为具有独特生物学行为的胃癌亚型，由于目前尚缺乏相关研究及确切有效的临床实验证据，因此未形成相对特异的治疗共识。通过对病毒感染、相关基因的异常、表观遗传异常及微小RNA调控等发病机制的深入探索，可能为寻找更具针对性的EBVaGC 治疗策略提供依据。TCGA 报道称，EBVaGC 具有PD-L1/PD-L2 过表达/扩增、PI3KCA 基因高频突变、ARID1A 缺失突变等分子特点［1，9］。目前，靶向PD-1/PD-L1 的众多抗体已在胃癌中开展相关临床试验，但EBVa患者是否能够成为免疫治疗获益人群亟需临床证实［10-11］。本研究围绕其基因特征进行深入地挖掘，重点关注EBV 裂解蛋白BZLF1。实验结果表明，BZLF1 可能通过激活PI3K/AKT 信号通路实现促进胃癌细胞的增殖、抑制其凋亡等作用。

为研究BZLF1 对胃癌细胞的影响，本研究首先验证BZLF1 过表达载体的成功构建并转染AGS 和HGC27 细胞，得到用于后续研究的细胞株。对比空载组，过表达BZLF1的胃癌细胞生长速度较快，凋亡比例较低。这与Szkaradkiewicz 等［12］的研究结果类似。在细胞的迁移、侵袭实验中，过表达BZLF1的细胞株并未与空载组产生显著差异，或许能部分解释临床中观察到EBVaGC 较少发生转移和预后较好的现象。

PI3K/AKT信号通路参与调控细胞增殖、凋亡、迁移等重要生物学过程，该通路的过度激活常与肿瘤发生相关。既往研究显示，EBV感染与PIK3CA基因或通路状态存在较强相关性［13-14］。本研究发现，BZLF1过表达的胃癌细胞AGS和HGC27分别存在pS6和pAKT表达上调，这提示PI3K/AKT通路抑制剂单独或联合免疫治疗可能成为EBVaGC的治疗策略。此外，Chen［15］的研究表明，PI3K/AKT途径的激活可导致对化疗的药物抗性。因此，针对该通路的抑制剂为靶向治疗EBVaGC中值得探索的道路。

本研究表明，EBV产物BZLF1可能通过激活PI3K/AKT信号通路而促进胃癌细胞生长，PI3K/AKT通路抑制剂或可成为EBVaGC的治疗选择之一。更多分子特征及潜在治疗靶点的挖掘尚需进一步研究。

致谢：感谢北京Gene Copoeia 公司完成的病毒BZLF1 基因表达载体的构建工作。