Tim-3/Galectin-9在原发性肝癌中的表达变化及临床意义探讨

兰勇 陈明 邢人伟

[摘要] 目的 探讨T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）/半乳糖凝集素-9（Galectin-9）在原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）中的表达变化及临床意义。 方法 回顾性分析2014年6月～2016年6月收治的110例接受根治性切除术的PLC患者的临床资料。检测并对比肝癌组织及癌旁组织中Tim-3、Galectin-9表达情况，统计Tim-3、Galectin-9不同表达情况时患者病理参数、随访1年内复发和死亡情况。 结果 肝癌组织中Tim-3阳性表达率显著高于癌旁组织（P<0.05），肝癌组织中Galectin-9阳性表达率显著低于癌旁组织（P<0.05）;Tim-3、Galectin-9阳性组与阴性组性别、年龄、肝硬化、血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、病理分型、TNM分期患者构成比比较差异不显著（P>0.05），Tim-3阳性组肿瘤直径≥5 cm、多發病灶、血管侵犯、无肿瘤包膜患者构成比显著高于阴性组（P<0.05），Galectin-9阳性组肿瘤直径≥5 cm、多发病灶、血管侵犯、无肿瘤包膜患者构成比显著低于阴性组（P<0.05）;术后1年内复发和死亡患者中Tim-3阳性表达率显著高于未复发和存活患者（P<0.05）;复发和死亡患者中Galectin-9表达率显著低于未复发和存活患者（P<0.05）。 结论 Tim-3的高表达、Galectin-9低表达与PLC多种病理学特征有关，且复发与未复发、死亡与存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表达存在差异，可能成为临床中评估PLC患者预后的重要指标之一。

[关键词] T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3;半乳糖凝集素-9;原发性肝癌;复发;死亡

[中图分类号] R735.7          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）04-0049-05

[Abstract] Objective To investigate the expression changes and clinical significance of T cell immunoglobulin mucin-3（Tim-3）/Galectin-9 in primary liver cancer（PLC）. Methods The clinical data of 110 PLC patients who underwent radical resection from June 2014 to June 2016 were retrospectively analyzed. The expressions of Tim-3 and Galectin-9 in liver cancer tissues and adjacent tissues were detected and compared. The pathological parameters， the recurrence and death within 1 year of follow-up of patients with different expressions of Tim-3 and Galectin-9 were analyzed. Results The positive expression rate of Tim-3 in liver cancer tissue was significantly higher than that in adjacent tissues（P<0.05）. The positive expression rate of Galectin-9 in liver cancer tissue was significantly lower than that in adjacent tissue（P<0.05）. There was no significant difference in gender， age， liver cirrhosis， serum alpha-fetoprotein（AFP）， hepatitis B surface antigen（HBsAg）， pathological type， and the composition ratios of TNM staging in Tim-3 and Galectin- 9 positive and negative groups（P>0.05）. The composition ratio of tumor diameter ≥5 cm， multiple lesions， vascular invasion， no tumor capsules in Tim-3 positive group was significantly higher than that in the negative group（P<0.05）. The composition ratio of tumor diameter ≥5 cm， multiple lesions， vascular invasion， and tumor-free capsule was significantly lower than that of the negative group（P<0.05）. The positive rate of Tim-3 expression in patients with recurrence and death within 1 year after surgery was significantly higher than that in patients without recurrence and survival（P<0.05）. The expression rate of Galectin-9 was significantly lower in patients with relapse and death than that in patients without recurrence and survival（P<0.05）. Conclusion The high expression of Tim-3 and the low expression of Galectin-9 are related to various pathological features of PLC， and there are differences in the expression of Tim-3 and Galectin-9 in patients with recurrence and non-recurrence， and in death and survival patients. They may become one of the important indicators for evaluating the prognosis of PLC patients.

[Key words] T cell immunoglobulin mucin-3; Galectin-9; Primary liver cancer; Recurrence; Death

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高[1]。由于早期无症状或症状不明显，确诊时多数患者已至局部晚期或远端转移，治疗难度增加且预后差，术后1年复发率超过30%，而术后5年生存率不足10%，给人们的健康和生命造成严重威胁[2]。随着分子生物学研究逐渐深入，人们发现机体免疫系统失衡在肿瘤进展过程中起重要作用。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）是一种优势表达于Ⅰ型辅助性T淋巴细胞（type Ⅰ helper T lymphocyte，Th1）表面的特异性表面标志物，通过Tim-3/半乳糖凝集素-9（Galectin-9）信號通路调节Th1/Th2免疫平衡，进而参与肿瘤进展[3-4]。但Tim-3、Galectin-9在PLC中的表达及其对预后的影响鲜有报道。鉴于此，本研究回顾性分析我院收治的PLC患者的临床资料，通过分析Tim-3、Galectin-9在癌组织及癌旁组织中的表达情况，并分析其与临床病理特征及预后的关系，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料

回顾性分析2014年6月～2016年6月收治的110例接受根治性切除术的PLC患者的临床资料，其中男72例，女38例，年龄38～72岁，平均（51.35±6.80）岁，肝硬化91例，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性98例，肿瘤直径<5 cm者73例、≥5 cm者37例，病理分型[5]：肝细胞癌99例、胆管细胞癌9例、混合癌2例，美国癌症联合委员会TNM分期[6]：Ⅰ～Ⅱ期者82例、Ⅲ～Ⅳ期者28例，单发病灶76例、多发病灶34例。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准  （1）病理学确诊为PLC;（2）行根治性切除术，术后组合考虑接受辅助放化疗;（3）随访时间≥1年者;（4）临床资料完整者。

1.2.2 排除标准  （1）合并其他原发性肿瘤者;（2）严重贫血、感染或合并严重凝血功能障碍及心血管疾病者;（3）妊娠期或哺乳期妇女。

1.3 方法

1.3.1 资料收集  统计患者就诊时间、性别、年龄、术前血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平、HBsAg、病理类型及TNM分期、肿瘤直径、病灶是否单发、是否肝硬化、肿瘤是否有包膜覆盖、是否发生血管侵犯等基本资料。统计患者术后1年内复发或死亡情况。复发诊断：经穿刺活检证实术后复发情况。

1.3.2 Tim-3、Galectin-9阳性表达检测  应用免疫组织化学法检测肝癌组织及癌旁组织中Tim-3、Galectin-9表达情况。A切片：取肝癌组织及癌旁组织常规制作石蜡切片，切片机制作4 μm连续切片;B脱蜡及水化：切片经二甲苯脱蜡后，依次放入二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅲ 5 min，并利用不同浓度梯度酒精（100%→95%→85%→70%→50%）水化;C抗原热修复：将预处理的柠檬酸盐抗原修复液放置于压力锅中，加热至沸腾后将切片放入压力锅中，当压力阀喷气后继续加热2 min停止加热，自然冷却，取出切片用自来水冲洗，并将其浸泡于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）缓冲液中;D染色前处理：用免疫组化专用笔在组织周围画圈标注，再用PBS洗涤3次，每次5 min，玻片自然晾干，加入3%的过氧化氢孵育20 min，PBS洗涤3次，每次5 min;E滴加抗原：每张切片分别加入50 μL一抗（鼠抗人Tim-3、Galectin-9单抗，Thermo公司），尽可能覆盖组织，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次每次5 min，然后加入二抗（山羊抗鼠Tim-3、Galectin-9 免疫球蛋白G，Thermo公司），室温孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min;F显色：辣根过氧化物酶显色试剂盒（R&D公司）显色，光镜下观察控制反应时间，显色满意后自来水冲洗，中性树胶封片;G光镜下观察：在200倍光镜下随机选取5个不重复的视野，以细胞呈现黄色或棕黄色判定为阳性细胞，计算阳性细胞率，并进行蛋白表达程度判定[7]：阳性细胞率<10%记为阴性，阳性细胞率≥10%记为阳性。

1.4观察指标

①对比Tim-3、Galectin-9不同部位表达率;②Tim-3、Galectin-9表达与病理参数的关系;③复发与未复发患者Tim-3、Galectin-9表达差异;④死亡与存活患者Tim-3、Galectin-9表达差异。

1.5统计学分析

采用SPSS17.0统计学软件对数据分析处理，计数资料以[n（%）]表示，理论频数≥0且≤5时组间计数资料进行校正检验，理论频数>5组间计数资料进行χ2检验;采用秩和检验分析等级计数资料。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tim-3、Galectin-9不同部位表达率比较

肝癌组织中Tim-3阳性表达率显著高于癌旁组织（P<0.05），肝癌组织中Galectin-9阳性表达率显著低于癌旁组织（P<0.05）。见表1、封三图8。

2.2 Tim-3、Galectin-9表达与病理参数的关系

Tim-3阳性组与阴性组性别、年龄、肝硬化、AFP水平、HBsAg、病理分型、TNM分期患者构成比比较，差异均无统计学意义（P>0.05），Tim-3阳性组肿瘤直径≥5 cm、多发病灶、血管侵犯、无肿瘤包膜患者构成比显著高于阴性组（P<0.05）;Galectin-9阳性组与阴性组性别、年龄、肝硬化、AFP水平、HBsAg、TNM分期、病理分型患者构成比比较，差异均无统计学意义（P>0.05），Galectin-9阳性组肿瘤直径≥5 cm、多发病灶、血管侵犯、无肿瘤包膜患者构成比显著低于阴性组（P<0.05）。见表2。

2.3复发与未复发患者Tim-3、Galectin-9表达差异

术后1年内复发患者中Tim-3阳性表达率明显高于未复发患者，差异有统计学意义（P<0.05）;复发患者中Galectin-9表达率明显低于未复发患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 死亡与存活患者Tim-3、Galectin-9表达差异

术后1年内死亡患者中Tim-3阳性表达率明显高于存活患者，差异有统计学意义（P<0.05）;死亡患者中Galectin-9表达率明显低于存活患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3讨论

PLC是一种高发恶性肿瘤，主要包括肝细胞癌、肝内胆管细胞癌及混合性癌等多种病理类型，肝炎病毒感染、家族疾病史、嗜酒及黄曲霉毒素长期暴露等均是导致PLC发病的危险因素[8-9]。随着医疗技术的飞速发展，癌症的治疗取得了较大进步，但PLC患者的预后仍然较差，中位生存期不足1.5年[10]。因此，亟需寻找早期预测复发和转移的标志物，以及时制定并实施有效治疗措施，对改善PLC患者预后、延长生存期有重要意义。

本研究发现，肝癌组织中Tim-3阳性表达率显著高于癌旁组织（P<0.05），肝癌组织中Galectin-9阳性表达率显著低于癌旁组织（P<0.05），提示肝癌组织中Tim-3异常高表达、Galectin-9异常低表达。Tim-3是一种优势表达于CD4+、CD8+细胞表面的一种抑制性分子，可调节Th1细胞免疫功能，且抑制干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的生成[11]。高表达的Tim-3可影响肿瘤微环境中的IFN-γ生成及Th1细胞功能，下调免疫系统功能，利于肝癌细胞的免疫逃避[12]。Galectin-9是β-半乳糖苷结合蛋白家族重要成员之一，在T细胞及胸腺细胞的发育、肿瘤细胞的分化、转移方面发挥重要作用[13]。Galectin-9是Tim-3的特异性配体，二者结合可介导T细胞免疫耐受[14]。既往研究发现[15-16]，多种肿瘤组织如黑色素瘤、乳腺癌组织中，Galectin-9呈阴性表达，而在正常组织中高表达，与本研究结果一致。由此，PLC患者癌组织中Tim-3异常高表达与Galectin-9的异常低表达，利于肝癌细胞增殖。

此外，本研究中，Tim-3阳性组肿瘤直径≥5 cm、多发病灶、血管侵犯、无肿瘤包膜患者构成比显著高于阴性组（P<0.05），Galectin-9阳性组上述指标显著低于阴性组（P<0.05）;术后1年内复发和死亡患者中Tim-3阳性表达率显著高于未复发和存活患者（P<0.05）;复发和死亡患者中Galectin-9表达率显著低于未复发和存活患者（P<0.05），提示Tim-3、Galectin-9与PLC多种病理学特征有关，且复发与未复发、死亡与存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表达存在差异。癌组织中浸润的大部分CD8+ T淋巴细胞表面Tim-3大量表达，但该表型中的T细胞增殖及分泌炎症细胞因子的功能基本丧失，且与肿瘤恶性程度密切相关[17]。Tim-3参与肿瘤浸润及转移与血管形成、肿瘤微环境缺氧、免疫逃逸等多种调节机制，可能是导致不同临床表现患者Tim-3表达差异的原因[18]。既往研究证实，多种肿瘤组织中Galectin-9呈强阳性表达，并与患者预后有关，如在乳腺癌组织中，伴远端转移的Galectin-9阳性患者无复发生存率为95%，显著高于阴性表达者的44%，有淋巴结转移的阳性患者生存率达90%，显著高于阴性表达者的25%[19-20]。癌组织中Galectin-9高表达者有效抑制肿瘤进展，可能是高表达Galectin-9与高表达Tim-3的Th1细胞结合，重新调节Th1/Th2平衡状态，利于肿瘤微环境的免疫监视作用，改善PLC患者的预后[21]。因此，Tim-3、Galectin-9表达情况与PLC患者的多种病理特征有关，并且可影响患者预后。

综上所述，Tim-3的高表达、Galectin-9低表达与PLC多种病理学特征有关，且复发与未复发、死亡与存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表达存在差异，提示临床中可通过检测此二种蛋白在肝癌组织中的表达评估预后，并可通过积极控制Tim-3、Galectin-9的表达，干扰PLC进展，进而改善预后。

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（收稿日期：2018-07-13）