肾素-血管紧张素系统在慢性束缚应激诱导的小鼠白细胞介素表达中的作用

康登峰 肖体先 吴天翼等

[摘要] 目的 探讨肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）在慢性束缚应激诱导下对小鼠白细胞介素表达的作用。 方法 以慢性束缚应激法建立应激模型，对其中部分小鼠注射血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI）以阻断RAS。本实验将50只雄性C57小鼠随机平均分为5组：对照组（Ctrl）、束缚一周组（R1w）、束缚一周+ACEI组 （R1w+ACEI）、束缚二周组（R2w）、束缚二周+ACEI组（R2w+ACEI），其中R1w+ACEI和R2w+ACEI两组束缚前30 min腹腔注射卡托普利，最后采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12的浓度。 结果 与Ctrl组相比，R1w组IL-2、IL-4、IL-6、IL-12浓度明显升高（P<0.05），R2w组 IL-2、IL-4、IL-6浓度明显升高（P<0.05）;卡托普利处理一周及二周以后IL-12的浓度显著下降（P<0.05）。 结论 慢性束缚应激初期可引起免疫因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-12水平增高，机体处于高免疫活性状态。RAS参与了慢性束缚应激诱导的IL-12的激活，与IL-2、IL-4、IL-6无关。

[关键词] 肾素-血管紧张素系统（RAS）;应激;白介素;免疫

[中图分类号] R392          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）04-0031-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of renin-angiotensin system（RAS）on the expression of interleukin in mice induced by chronic restraint stress. Methods A stress model was established by chronic restraint stress method. Some mice were injected with angiotensin -converting enzyme inhibitor（ACEI） to block RAS. In this experiment， 50 male C57 mice were randomly divided into 5 groups： control group（Ctrl）， restraint one-week group（R1w）， restraint one week+ACEI group（R1w+ACEI）， restraint two-week group （R2w）， and restraint two-week +ACEI group（R2w+ACEI）， in which R1w+ACEI and R2w+ACEI were intraperitoneally injected with captopril 30 min before the restraint. And finally serum concentration of IL-2， of IL-4， IL-6 and IL-12 was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results Compared with that of the Ctrl group， the concentration of IL-2， IL-4， IL-6 and IL-12 in the R1w group was significantly increased（P<0.05）， and the concentration of IL-2， IL-4 and IL-6 in the R2w group was significantly increased（P<0.05）. IL-12 concentrations were significantly decreased after one week and two weeks of captopril treatment（P<0.05）. Conclusion The early stage of chronic restraint stress can cause the levels of immune factors IL-2， IL-4， IL-6 and IL-12 to increase， and the body is in a state of high immunological activity. RAS is involved in the activation of IL-12 induced by chronic restraint stress， independent of IL-2， IL-4， and IL-6.

[Key words] Renin-angiotensin system（RAS）;Stress;Interleukin;Immunity

隨着社会发展，竞争日益激烈，带给人们的压力与挑战使人们处于慢性应激状态下。目前有研究证实，长期及反复的慢性应激能够对动物和人类的免疫功能产生抑制[1]。肾素-血管紧张素系统是重要的体液调节系统，对水电解质与血压调节具有重要作用。有研究表明，循环及组织内RAS也是一个应激激素反应系统，与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis，HPA）和交感-肾上腺髓质系统（Sympathetic-adrenal medulla system，SAMS）之间存在着密切联系[2]，应激时RAS成分表达增加[3]，说明RAS参与了应激反应。肾素-血管紧张素系统信号级联的多个组分均会影响炎性细胞表型和功能，均会影响机体的免疫功能[4]，其中血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ）可能导致肾小球肾炎中的蛋白尿和肾组织损伤，而血管紧张素转化酶抑制剂可以减少这一损伤[5]，另外，有研究表明Ang Ⅱ可直接促进T细胞增生[6]。如前所述，RAS系统对免疫功能的影响，在过去的研究中，已有多个方向且较完整的认识，本研究则以此为基础，引入慢性应激因素，继续探讨其影响。这一方面的研究仍然较少。本研究利用慢性束缚应激雄性C57小鼠，通过卡托普利阻断RAS，采用酶联免疫吸附试验测定小鼠血清中白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-6、IL-12水平的变化，比较阻断与不阻断RAS对各白介素水平的影响，来探究以下2个问题：（1）慢性束缚应激引起白介素的变化;（2）RAS是否在这个变化中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

2018年6月1日于苏州大学医学部基础医学与生物科学学院生理学系实验室开始实验。健康雄性C57小鼠50只，由苏州大学实验动物中心提供。小鼠体重中位數25 g（20～28 g）。饲养温度（20±2）℃，湿度（55±5）%。6月1日将动物随机分为五组：①对照组（Ctrl）10只：不进行应激处理，正常饲养;②束缚1周组（R1w）10只，束缚应激6 h/d，持续1周;③束缚1周+卡托普利组（R1w+ACEI）10只，束缚应激6 h/d，持续1周，腹腔注射卡托普利;④束缚2周组（R2w）10只，束缚应激6 h/d，持续2周;⑤束缚2周+卡托普利组（R2w+ACEI）10只，束缚应激6 h/d，持续2周，腹腔注射卡托普利。自然光照循环条件下适应环境7 d后（6月8日）开始制作动物模型，每3天更换一次笼舍和垫料。实验中除应激期间外均自由饮水及摄食。R1w 组和R1w+ACEI组于6月14日完成模型制作并取血，6月21日完成R2w 组和R2w+ACEI组模型制作并取血。Ctrl组于6月21日取血。

1.2 慢性束缚应激和腹腔注射卡托普利

使用50 mL离心管制作束缚应激装置，将管壁不同部位钻出直径3 mm的小孔，以防止小鼠窒息[7]。将小鼠头朝向管底放入离心管后封闭管口，以达束缚效果，每天6 h（12：00～18：00），束缚期间禁食禁水，6 h后将小鼠恢复自由。卡托普利是一种血管紧张素转化酶抑制剂，将卡托普利粉剂[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，产品编码：C1580]溶于生理盐水中制得浓度为2.5 mg/mL的卡托普利溶液。R1w+ACEI和R2w+ACEI两组小鼠，按小鼠体重30 mg/kg进行腹腔注射，注射时间为束缚应激前30 min。本实验方案经苏州大学实验动物护理和使用委员会批准后使用。

1.3 标本采集和指标测定

小鼠以4%水合氯醛0.2 mL/只腹腔注射麻醉后摘眼球取血。血样静置2 h后常温4000 r/min离心10 min取上层血清，-80℃保存。血清样本使用小鼠IL-2、IL-4、IL-6、IL-12/p70 ELISA试剂盒（达科为生物技术有限公司）于6月22～25日测定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12的浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 束缚应激对IL-2、IL-4、IL-6、IL-12浓度的影响

2.2 ACEI治疗1周后对白介素表达的影响

束缚应激同时，采用ACEI治疗1周后，IL-2（5.79±0.59）pg/mL、IL-4（40.90±8.98）pg/mL、IL-6（35.31±3.50）pg/mL变化无统计学差异（t=0.141、0.209、0.348，P>0.05），IL-12（27.34±3.63）pg/mL浓度明显下降（t=0.009，P<0.05）。见图2。

2.3 ACEI治疗2周后对白介素表达的影响

束缚应激同时，采用ACEI治疗2周后，IL-2（4.11±1.09）pg/mL、IL-4（37.70±7.44）pg/mL、IL-6（27.44±2.58）pg/mL变化无统计学差异（t=0.155、0.269、0.323，P>0.05），IL-12（11.07±3.86）pg/mL浓度明显下降（t=0.014，P<0.05）。见图3。

3 讨论

本研究利用慢性束缚法建立动物模型，对躯体不造成物理伤害刺激，很好地模拟了人类慢性抑郁焦虑状态[8]。既往研究已证实，慢性应激抑郁症患者血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、干扰素-c、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等促炎细胞因子水平升高[9]。应激可以引起机体中枢及外周免疫系统的激活，特别是细胞因子的大量分泌[10]。

在免疫系统、中枢神经系统和内分泌系统之间，某些信息交流是通过特定的细胞因子产生作用的，这些细胞因子可以促使大脑产生化学物质及内分泌激素，引起神经和免疫的改变，在维持稳态及造成某些病理改变中，起重要的调节作用[11]。IL-2、IL-4、IL-6、IL-12均为重要的机体免疫相关细胞因子。其中IL-2通过其对CD4+ T调节（Treg）细胞和细胞毒性效应淋巴细胞的作用，参与调节免疫耐受和活化[12]。IL-4在调节抗体产生，造血和炎症以及效应T细胞应答的发展中具有重要作用[13]。IL-6具有环境依赖性的促进和抗炎特性，目前被认为是临床干预的重要靶点[14]。IL-12是一种重要的促炎性细胞因子，已被证明在体外和体内具有强大的免疫调节、抗肿瘤和抗感染活性[15]。

血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂卡托普利（captopril）是常用的ACEI类药物，通过抑制血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）的活性，减少Ang Ⅱ的生成，阻断RAS的作用而产生生物效应。Wohleb ES等[16]研究发现卡托普利能显著抑制LPS诱导的DC的IL-12的产生，另外有研究显示，卡托普利可以使慢性心力衰竭大鼠心肌中TNF-α、IL-6水平[17]及IL-1β、NF-κB水平[18]下降。可见，卡托普利一定程度上具有降低炎症细胞因子的能力。

本研究显示，R1w组较Ctrl组，所测各白介素浓度均明显增高，R2w组IL-2、IL-4、IL-6浓度明显增高，而IL-12浓度有升高趋势但并不显著，但可认为其维持在较高水平，说明束缚应激激活炎症通路，使得白介素浓度升高。显然，当小鼠处于应激状态时，机体免疫相关白介素也处于激活状态，这很有可能进一步促使机体免疫细胞激活。但我们也观察到，束缚4周时，四组白介素均略有下降趋势。有研究显示，在四周以上的慢性束缚应激中，IL-2在脾中含量相较于正常情况明显下降，因此，进一步延长实验时间或许有助于得出更加精确的结论[19]。

由实验数据可以看出，卡托普利治疗1周及2周以后，IL-12浓度显著下降，IL-2、IL-4、IL-6浓度未出现明显变化，故RAS在慢性应激情况下不影响IL-2、IL-4、IL-6的表达，但其对IL-12的水平有重要影響。有研究表明，Ang Ⅱ通过降解IKBα（NF-kappa-B inhibitor alpha）及IKBβ（NF-kappa-B inhibitor beta）来激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB），使NF-κB进入胞浆，进而与细胞核内炎症反应调节蛋白基因的启动子区域结合，调控各种炎症基因转录，形成各种炎症因子[20]。本研究中使用了卡托普利后，IL-12浓度显著下降，可能原因是卡托普利减少了Ang Ⅱ的产生，从而减少了IL-12的生成。Ravichandran K等[21]的研究结果显示，血管紧张素原（Angiotensinogen，AGT）反义寡核苷酸（AGT antisense oligonucleotide，ASO）会抑制AGT mRNA，使AGT减少，进而会导致机体IL-12浓度的下降。在本实验中，RAS被卡托普利阻断，则机体内AGT的产生会减少，IL-12缺少了促进其产生的刺激因素，从而浓度下降。如前文所述，IL-12可有效抑制肿瘤的发展，相关免疫疗法已在研究中[22]。也有研究显示，高浓度的IL-12会导致多种免疫性疾病，例如Ⅰ型糖尿病[23]、类风湿性关节炎[24]，银屑病[25]等。提示在长期慢性应激的情况下，阻断RAS会使得机体患癌风险提高，但对于已患有某些免疫性疾病的患者，RAS的阻断可能对治疗原发病有所帮助。

综上所述，本研究通过对小鼠的慢性束缚应激发现免疫因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-12水平增高，提示当机体处于长期应激状态初期，机体免疫系统被激活，处于活跃状态。同时发现RAS参与了慢性束缚应激诱导的IL-12的激活，与IL-2、IL-4、IL-6无关。由于本研究尚处于起始阶段，所研究白介素种类较少，研究时间较短，但依旧可以为研究肾素-血管紧张素系统与机体免疫功能的关系提供参考，为进一步得出该系统对机体免疫功能的影响提供思路。

[参考文献]

[1] Dhabhar FS. Effects of stress on immune function：The good，the bad， and the beautiful[J]. Immunologic Research，2014，58（2-3）：193-210.

[2] 杨钢，万瑜，万曙霞，等. 肾素-血管紧张素系统——应激激素反应系统[J]. 湖北医药学院学报，1995，（3）：155-157.

[3] Wang LH，Dong T，Liu BB，et al. Contribution of the renin-angiotensin system in chronic foot-shock induced hypertension in rats[J]. Life Sciences，2015，121：135-144.

[4] Crowley SD，Rudemiller NP. Immunologic effects of the renin-angiotensin system[J]. Journal of the American Society of Nephrology，2017，28（5）：1350-1361.

[5] Hisada Y，Sugaya T，Yamanouchi M，et al. Angiotensin Ⅱ plays a pathogenic role in immune-mediated renal injury in mice[J]. Journal of Clinical Investigation，1999，103（5）：627.

[6] Nataraj C，Oliverio MI，Mannon RB，et al. Angiotensin Ⅱ regulates cellular immune responses through a calcineurin-dependent pathway[J]. Journal of Clinical Investigation，1999，104（12）：1693-1701.

[7] Yin D，Tuthill D，Mufson RA，et al. Chronic restraint stress promotes lymphocyte apoptosis by modulating Cd95 expression[J]. Journal of Experimental Medicine，2000，191（8）：1423-1428.

[8] Buynitsky T，Mostofsky DI. Restraint stress in biobehavioral research：Recent developments[J]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews，2009，33（7）：1089-1098.

[9] 王艳，张蒙夏，谭思杰，等. 慢性应激与抑郁症发病机理研究进展[J]. 中南医学科学杂志，2015，（6）：703-707.

[10] 彭云丽，王雯英，蒋春雷，等. 应激诱发抑郁症的细胞因子机制研究进展[J]. 生理学报，2013，65（2）：229-236.

[11] 王曼，胡贤，金魁和. 慢性应激对大鼠脑内白介素-18表达的影响[J]. 中华行为医学与脑科学杂志，2010，19（5）：405-407.

[12] Boyman O，Kolios AG，Raeber ME. Modulation of T cell responses by IL-2 and IL-2 complexes[J]. Clinical & Experimental Rheumatology，2015，33（4 Suppl 92）：54.

[13] Melissa A. Brown，John Hural. Functions of IL-4 and control of its expression[J]. Crit Rev Immunol，1997，17（1）：1.

[14] Hunter CA，Jones SA. IL-6 as a keystone cytokine in health and disease[J]. Nature Immunology，2015，16（5）：448-457.

[15] Wang Y，Fan KT， Li JM，et al. The regulation and activity of interleukin-12.[J]. Frontiers in Bioscience，2012，4（3）：888-899.

[16] Wohleb ES，Mckim DB，Sheridan JF，et al. Monocyte trafficking to the brain with stress and inflammation：A novel axis of immune-to-brain communication that influences mood and behavior[J]. Front Neurosci，2014，8：447.

[17] 治丁銘，刘岩，赵鸿飞，等. 针刺对大鼠心肌组织细胞因子的影响[J]. 中国老年学杂志， 2016，36（1）：19-21.

[18] 郑惠萍，张双伟，陈洁，等. 毛冬青对慢性心力衰竭大鼠模型炎症相关因子的影响[J]. 中药新药与临床药理，2014，25（2）：183-185.

[19] 李建，胡淞，张才全，等. 慢性束缚应激对昆明小鼠脾淋巴细胞免疫功能及小鼠前胃癌移植瘤生长的影响[J].癌症，2008，27（5）：471-475.

[20] 于丽娜，徐延敏. 血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂在动脉粥样硬化中的研究进展[J]. 实用心脑肺血管病杂志，2010，18（1）：88-91.

[21] Ravichandran K，Ozkok A，Wang Q，et al. Antisense-mediated angiotensinogen inhibition slows polycystic kidney disease in mice with a targeted mutation in Pkd2[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2015，8（4）：F349-357.

[22] Colombo MP，Trinchieri G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews，2002，13（2）：155-168.

[23] Trembleau S，Penna G，Gregori S，et al. IL-12 administration accelerates autoimmune diabetes in both wild-type and IFN-gamma-deficient nonobese diabetic mice， revealing pathogenic and protective effects of IL-12-induced IFN-gamma[J]. Journal of Immunology，2003，170（11）：5491.

[24] Mcintyre KW，Shuster DJ，Gillooly KM，et al. Reduced incidence and severity of collagen-induced arthritis in interleukin-12-deficient mice[J]. European Journal of Immunology，2010，26（12）：2933-2938.

[25] Yawalkar N，Tscharner GR，Hassan A. Increased expression of IL-12p70 and IL-23 by multiple dendritic cell and macrophage subsets in plaque psoriasis[J]. Journal of Dermatological Science，2009，54（2）：99-105.

（收稿日期：2018-10-11）