不同龈下菌斑清除方式对龈沟液中细胞凋亡因子、炎症因子及MMPs/TIMPs平衡的影响

张莉 李卫民

慢性牙周炎约占牙周炎患者的95%以上，由牙龈炎过渡所致，主要病理表现包括牙周袋形成、牙槽骨吸收，晚期可出现牙齿松动及移位，严重影响患者的生活质量[1-2]。龈下菌斑形成是牙周疾病发生的重要基础[3]，及时清除龈下菌斑、抑制菌斑所致牙周炎症，是目前慢性牙周炎治疗的可靠方法，但具体操作方法的选择仍存在争议。手器刮治是龈下菌斑清除的传统方式，操作便捷但是术后残留菌斑发生率较高[4]。喷砂刮治属于新型菌斑清除方式，具有高效、菌斑清除彻底等优势[5]。为了选择慢性牙周炎龈下菌斑清除的最优方式，本研究将2 种治疗方法用于临床慢性牙周炎患者中，从牙周组织细胞凋亡、龈沟液(GCF)炎症反应及基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制剂(MMPs/TIMPs)平衡等方面探讨其应用价值差异。

1 资料与方法

1.1 病例资料

2015-01～2017-01间在本院接受治疗的慢性牙周炎患者128 例，患者本人或者家属签署知情同意书。按照随机数表法将入组患者分为手器刮治组、喷砂组各64 例，手器刮治组中男性33 例、女性31 例，年龄36～74 岁， 平均(49.26±8.13) 岁； 喷砂组中男性34 例、 女性30 例， 年龄34～75 岁，平均(49.17±7.95) 岁。 2 组患者基线资料组间比较，P>0.05。研究方案经医院伦理委员会批准。

1.2 入组及排除标准

入组标准：①接受基础治疗≥1月； ②口内左右2 个象限内有探诊深度3～6 mm的牙位； ③全程配合治疗及检查，无中途自主离组，数据获取完整。排除标准： ①伴龈下修复体，或者Ⅱ度以上根分叉病变；②剩余牙槽骨高度<1/3； ③合并其他组织脏器感染性疾病；④合并严重自身免疫性疾病。

1.3 治疗方法

手器刮治组患者接受手器刮治治疗，采用Gracey刮治器、刮治深度为工作端无肉眼可见袋内龈下菌斑。喷砂组患者接受喷砂刮治，在龈下喷砂机操作下将甘氨酸粉末的压力设置为中档(保证龈下工作端与牙长轴平行)，放置龈下工作端于牙周袋中(稍有抵抗感为宜)，对远、近、颊、舌4 个牙面进行喷砂(持续时间约为5 s)，期间保证龈下工作端不移出牙周袋。

1.4 龈沟液标本获取

治疗前、治疗后7 d，均获取2 组患者的龈沟液标本，具体步骤如下：将裁剪为10 mm×2 mm的滤纸条放置在龈下菌斑对应位置， 30 s后取出并放入无菌EP管中、冻存于-70 ℃深低温环境下。检测时将滤纸放入pH值为7.5的缓冲液中，震荡离心(4 ℃、10 000 r/min、 10 min)，采集上清液。

1.5 凋亡分子表达

采用荧光定量PCR法测定龈沟液标本中凋亡分子Bcl-2、 Bax、 Caspase-3的表达量。具体步骤如下：裂解细胞→4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取无色水相上层→异丙醇沉淀其中总RNA→清洗RNA沉淀、室温空气干燥→测定RNA纯度及浓度→反转录试剂盒合成样品cDNA→荧光定量PCR试剂盒扩增目标基因。设置手器刮治组治疗前龈沟液中凋亡分子的表达量为标准值100，计算不同时间点、不同组内相同凋亡分子的表达量。

1.6 炎症反应、MMPs/TIMPs平衡

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定龈沟液标本中超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等炎症因子的含量；采用ELISA测定标本液中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-8(MMP-8)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、 金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的含量。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 凋亡分子表达

治疗前， 2 组患者龈沟液中凋亡分子Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达量的差异无统计学意义(P>0.05)。 治疗后7 d， 2 组患者龈沟液中Bcl-2 mRNA的表达量高于治疗前， Bax、Caspase-3 mRNA的表达量低于治疗前，且喷砂组患者龈沟液中Bcl-2 mRNA的表达量高于手器刮治组，Bax、Caspase-3 mRNA的表达量低于手器刮治组(P<0.05)(表1)。

2.2 炎症因子

治疗前， 2 组患者龈沟液中炎症因子hs-CRP、IL-6、IL-10含量的差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后7 d， 2 组患者龈沟液中hs-CRP、 IL-6的含量低于治疗前，IL-10的含量高于治疗前，且喷砂组患者龈沟液中hs-CRP、IL-6的含量低于手器刮治组患者，IL-10的含量高于手器刮治组患者(P<0.05)(表2)。

Tab 1 Comparison of apoptotic molecular expression in GCF between 2 groups before and after treatment (n=64,

注： 与组内治疗前比较， ①P<0.05

2.3 MMPs/TIMPs平衡

治疗前， 2 组患者龈沟液中MMP-2、 MMP-8、 MMP-13、 TIMP-1含量的差异无统计学意义(P>0.05)； 治疗后7 d， 2 组患者龈沟液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量低于治疗前，TIMP-1的含量高于治疗前，且喷砂组患者龈沟液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量低于手器刮治组患者，TIMP-1的含量高于手器刮治组患者(P<0.05)(表3)。

Tab 2 Comparison of inflammatory factors in GCF between 2 groups before and after treatment (n=64,

注：与组内治疗前比较， ①P<0.05

Tab 3 Comparison of MMPs/TIMPs factor contents in GCF between 2 groups before and after treatment (n=64, ng/ml，

注： 与组内治疗前比较， ①P<0.05

3 讨 论

龈下菌斑是导致慢性牙周炎发生发展的重要病理基础，菌斑中细菌定植数量及毒力可直接造成牙周炎症发生、牙槽骨吸收及功能破坏，故清除龈下菌斑是慢性牙周炎治疗的可靠方法[6]。手器刮治是临床应用时间较久的传统治疗手段，在刮治过程中只能做到与牙面点、线接触，故在清除菌斑的彻底性方面存在隐患。喷砂刮治利用新型甘氨酸喷砂技术，将直径<25 μm、莫氏硬度为2的甘氨酸粉末及3 个互呈120°夹角的喷砂工作尖共同作用于菌斑表面，在不损伤牙体硬组织的前提下彻底清除根面及牙周袋壁的菌斑[7]。本次研究亦将其分别用于慢性牙周炎患者的治疗，从牙周组织中细胞凋亡、炎症反应及MMPs/TIMPs平衡等微观方面判断临床应用效果差异。

已经有研究证实，牙菌斑中的多种致病菌可引起牙槽骨中的成骨细胞增殖能力降低、细胞凋亡活性增加，说明细胞凋亡与牙周炎的发生存在密切联系[8-9]。牙菌斑的清除可解除致病菌对牙周组织细胞活性的干扰，菌班清除有效性与细胞凋亡活性直接相关。Bcl-2是具有阻断程序化细胞死亡功能的主要分子，有助于延长细胞存在，在牙周炎病灶组织中存在Bcl-2的表达量减[10]。Bax、Caspase-3均属于凋亡执行分子，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用并加速细胞程序性死亡[11]。本次研究发现： 2 组患者治疗后龈沟液中Bcl-2 mRNA的表达量均增加，Bax、Caspase-3 mRNA的表达量均减少，说明两种菌斑清除方式均可不同程度抑制牙周组织的细胞凋亡；进一步与手器刮治组比较，喷砂组治疗后龈沟液中Bcl-2 mRNA的表达量较高，Bax、Caspase-3 mRNA的表达量较低，说明喷砂组可更为有效的逆转牙周组织的抗凋亡/促凋亡失衡，间接说明喷砂组可更为有效的清除龈下菌斑。

龈下菌斑中的致病菌作用于牙周组织并导致局部炎症反应发生，大量炎症因子分泌于龈沟液中，其具体含量可客观反映牙周炎严重程度[12-13]。hs-CRP是最为典型、敏感度极高的炎症因子，在慢性牙周炎早期即可被检测到分泌增加，且进一步促使IL-6等促炎因子分泌，形成局部炎症级联反应[14]。IL-10是具有抗炎作用的典型因子，具有抑制炎症反应持续扩大的作用，当机体促炎因子大量分泌时IL-10被大量消耗并呈低水平，而当牙周炎症控制时局部抗炎能力增加、IL-10含量上升[15]。本次研究发现： 2 组患者治疗后龈沟液中hs-CRP、IL-6的含量降低，IL-10的含量增加，说明两种菌斑清除方式应用后龈沟液中的炎症反应程度均减轻；进一步与手器刮治组比较，喷砂组治疗后龈沟液中hs-CRP、IL-6的含量较低，IL-10的含量较高，证实喷砂刮治可更为有效的抑制慢性牙周炎患者的牙周局部炎症程度，这与该方式清除龈下菌斑的彻底性直接相关。

有研究指出基质金属蛋白酶(MMPs)的过表达是促使慢性牙周炎进展的重要因素，MMP-2、MMP-8、MMP-13作为其主要亚型，已经在不同研究中被证实高表达于龈沟液中，参与牙本质细胞、成牙骨质细胞的破坏[16-17]。TIMP-1可特异性抑制MMPs的作用，当其表达减少时对MMP-2、MMP-8、MMP-13等的抑制能力降低，导致牙周组织持续损害发生[18]。本次研究发现：与治疗前比较，两组患者治疗后龈沟液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量均降低，TIMP-1的含量增加，说明不同龈下菌斑去除方式均可不同程度逆转MMPs/TIMPs失衡状态；进一步与手器刮治组比较，喷砂组治疗后龈沟液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量较低，TIMP-1的含量较高，说明喷砂刮治可更为有效的协调慢性牙周炎患者的牙周MMPs/TIMPs平衡，间接证实喷砂刮治清除龈下菌斑的高效性。

综上所述， 传统手器刮治及喷砂刮治均可用于慢性牙周炎患者的龈下菌斑清除，但是喷砂刮治法可更为有效的恢复牙周组织的内环境稳态、逆转疾病侵袭性，更具有可行性及高效性，值得在临床推广应用。