1株降解磺化沥青菌株的筛选与鉴定

幸晶晶

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

江涛

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

磺化沥青是一种以沥青为原料，经磺化处理后得到的改性高分子化合物，是一种既可以部分溶于水又溶于油的棕黑色物质，能够分散在泥浆中起到良好的护壁和防塌效果[1，2]，具有良好的堵漏、防塌、润滑、减阻、控温等性能，曾作为水基钻井液，应用广泛。其主要成分为沥青磺酸盐、少量的沥青酚盐、无机物、氧化沥青、饱和烃及单、双环、多环芳烃等[3]，具有高色度、高化学需氧量(COD)、可生化性差等特点，属于难降解有机物[4]。针对于包含磺化沥青的钻井液的污染物降解，目前处理方法主要有化学法、物化法、生物法组合和工艺处理法4大类[5～10]，并都取得了较好的降解效果，但工艺较复杂、成本高，且容易产生二次污染。随着微生物处理技术的深化研究和工程实践经验的积累，微生物处理技术在有毒、有害的有机工业废水中的治理中具有成本低、降解完全、工艺简单、无二次污染等明显优势，得到了广泛的应用[11～14]。为此，本研究对降解磺化沥青的菌株进行了筛选与鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

磺化沥青粉和钻井泥浆由新疆克拉玛依某油田提供，原材料及水溶液状态分别如图1、图2所示。菌种来源于新疆克拉玛依油田钻井泥浆。

筛选培养基配方：硝酸钠1.5g、硫酸铵1.5g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、氯化钠5.0g、七水硫酸亚铁0.01g、氯化钙0.02g、超纯水1L、聚磺物(沥青)(0.05%)0.5g。

富集培养基配方：牛肉膏5g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂20g，超纯水1L，pH=7。

1.2 菌种筛选

1)菌种的初筛 将采自于新疆克拉玛依油田内的钻井泥浆，称取1g接入到筛选培养基中。以5d为1个周期，驯化培养5个周期后进行稀释平板涂布。驯化条件为35℃、150r/min。挑选菌落大小和颜色有差异的菌株作为初筛菌种。

2)菌种的复筛 将初筛菌落先接种至富集培养基在条件为35℃、150r/min进行富集扩大培养，吸取1mL富集菌液回接到液体筛选培养基中以5d为1个周期，驯化培养5个周期后，挑选生长良好的单菌落培养液进行稀释涂布至固体筛选培养基上进行纯化，再经显微镜观察菌株形态，得到菌落形态不同和菌体形态存在差异的复筛菌株。

图1 磺化沥青图2 磺化沥青水溶液

1.3 DNA提取

将筛选的菌种接到装有固体富集培养基的平皿内，生长48h后，挑选其中一个单菌落进行DNA提取。DNA提取方法为微波提取法，接一环菌落到装有50μL无菌水的EP管中，混匀。微波中火加热2 min后快速取出冰浴2min。

1.4 PCR扩增

16s rDNA上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR 扩增体系为50μL：2×Taq PCR Master Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板4μL，无菌水17μL。扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行凝胶电泳后送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选结果

将驯化的混合菌液稀释涂布进行初筛获得135个长势良好的单菌落。再经回接、纯化和形态观察进行复筛，得到6株生长状态优良的单菌落。挑选其中生长速度最快且长势最佳的菌株作为试验菌，命名为X2。

2.2 菌种的形态学鉴定

X2菌种菌落呈圆形，表面光滑，白色。挑选单菌落进行染色后观察，发现X2呈杆状，为革兰氏阳性菌。结果如图3和图4所示。

图3 X2单菌落图4 X2菌株镜检图

2.3 菌种的分子生物学鉴定

将菌种X2进行PCR扩增，扩增样品经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到以下片段：

图5 菌株X2系统发育树

将序列在NCBI数据库进行blast对比，结果显示X2菌株的DNA与FJ938121.1_Bacillus_sp._210_10菌株的相似度高达99.79%，构建分子系统发育树如图5所示，可以判定菌种X2属芽孢杆菌属(Bacillus)。

3 小结

经过初筛和复筛得到6株优良单菌，挑选其中1株长势最佳的菌株(命名为X2)进行形态观察及分子鉴定，判定菌种X2属芽孢杆菌属(Bacillus)。本研究结果为进一步的降解研究奠定了基础。