真菌Penicillium novae-zeelandiae HSD07B发酵产红色素研究

孙 瑞，段佩玲

(郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 451460)

色素主要有人工合成色素和天然色素，他们被广泛应用于化妆品工业、医药保健工业、食品工业、日用品工业等领域。长期使用合成色素易带来一系列问题，如可能的致癌、致畸、慢性中毒等，使得人们逐渐意识到合成色素的危害性。随着食品安全的社会需求越来越迫切，以天然色素代替合成色素成为必然趋势。

天然色素的来源极其丰富，一般可分四大类：矿物质色素、植物色素、动物色素、微生物色素。天然色素不仅具有着色效果，大部分色素还有一定的生理功能，如：番茄红素对心血管病和癌症等慢性疾病有一定缓解作用；姜黄素具有抗炎、抗感染、抗凝等多种药用生理功能。相对于合成色素的快速合成，从植物、动物等组织提取色素品种有限、工艺复杂、生产成本高，这些问题限制了天然色素的大量生产。微生物培养技术成熟、培养条件可控，为大规模生产色素提供了基础条件。目前，研究人员利用微生物发酵生产天然色素的技术和工艺越发成熟，通过各种手段优化发酵工艺，得到了如类胡萝卜素、红曲色素等多种天然色素。未来利用微生物发酵大规模生产天然色素将成为生产天然色素的主力。

在前期研究中，成功实现了酵母属假丝酵母(Candida sp.)和青霉(Penicillium novae-zeelandiae HSD07B)两种微生物混合发酵产生红色素。由于两种微生物混合发酵的技术工艺操作流程烦琐，致使该模式产色素的成本过高。本研究主要探索青霉发酵产红色素的能力和发酵条件。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

所用的菌种为青霉，该菌株由河南师范大学功能微生物绿色转化技术河南省工程实验室分离并保存。菌株保存和培养用培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，pH自然，使用前115 ℃灭菌30 min。

1.2 红色素浓度的测定

红色素浓度采用分光光度法进行测定，方法步骤如下：

研究表明红色素在495 nm处有最大吸收峰，对发酵培养得到的红色素进行一系列梯度稀释，蒸馏水为对照，用UV2600紫外分光光度计测定各稀释浓度红色素的吸光度。建立标准曲线，横坐标为吸光度，纵坐标为红色素浓度。对待测样品进行过滤、离心、稀释之后用紫外分光光度计在最大吸收波长处测定，对照标准曲线取值，乘以稀释倍数得到发酵液红色素产量。

1.3 分生孢子悬液制备

取4 mL已灭菌的无菌水移入PDA斜面培养基上活化后的菌株试管中，将接种环在酒精灯上灼烧片刻，冷却，置于试管中轻轻刮取斜面上生长的孢子，使孢子悬浮于注入的无菌水中，再将该混合液倒入盛有无菌水的三角瓶中，孢子悬液制备完成，待用。

1.4 培养条件对产红色素产量的影响

培养温度的影响：根据真菌正常生长的温度范围，本研究设置了18 ℃、24 ℃、30 ℃、36 ℃、42 ℃ 5个温度梯度探究温度对产红色素量的影响。

接种量的影响：分别取0.4 mL、0.7 mL、1 mL、1.3 mL、1.6 mL孢子悬液浓度为107 个/mL的培养物至300 mL新鲜培养基中。

pH酸碱度的影响：液体发酵培养基的初始pH用HCl分别调成5个pH酸碱度梯度，分别为2.0、4.0、6.0、8.0和10.0。将配置好的液体发酵培养基分装到容积为500 mL的锥形瓶中，每瓶装300 mL，封装后高压蒸汽灭菌锅灭菌。

培养方式的影响：30 ℃的恒温静置培养；30 ℃、160 r/min的恒温振荡培养；发酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒温振荡培养一定时间后，再30 ℃的恒温静置培养。

培养时间的影响：发酵瓶30 ℃、160 r/min恒温振荡分别培养35 h、38 h、41 h、44 h、47 h，然后置于30 ℃的恒温培养箱静置培养。

所有实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 标准曲线建立

用紫外分光光度计在最大吸收波长495 nm处测定吸光度，读取各数值后，绘制曲线，见图1，曲线回归方程为y=1.305x-0.0305(R2=0.9962)，这表明在一定浓度范围内红色素在波长495 nm处呈显著的线性相关。

图1 OD值与红色素浓度的线性关系

2.2 培养温度对产红色素的影响

温度对产红色素的影响见图2，在温度为18 ℃～30 ℃之间，色素的产量随温度上升而上升，在30 ℃～42 ℃之间与温度呈负相关，故30 ℃是产红色素的最佳发酵温度，产量达到1.48 mg/mL。

图2 温度对产红色素的影响

2.3 接种量对产红色素的影响

菌株的生长和代谢能力受很多因素的影响，其中接种量是决定因素之一。本研究设置5个孢子悬液接种量探讨菌种接种量对发酵产红色素的影响，接种的分生孢子悬液浓度均为1.5×107个/mL，结果见图3。接种量为0.4 mL到1 mL之间时产红色素量逐渐增加，之后随着接种量增加红色素产量减少，增加接种量并不能提高产量，故1mL是产红色素的最佳接种量。

图3 接种量对红色素产量的影响

2.4 pH酸碱度对产红色素的影响

在最适温度和接种量条件下，继续对培养初始pH酸碱度对产红色素的影响进行研究，结果见图4，在pH酸碱度为2.0到6.0之间时随初始pH酸碱度增加，红色素产量增加，而后红色素产量与初始pH酸碱度负相关，故pH酸碱度为6.0左右为最佳发酵培养产红色素的初始pH酸碱度，过酸或过碱的环境均不利于发酵产红色素。

图4 初始pH对产生红色素的影响

2.5 培养方式的影响

微生物最适宜生长和最适宜代谢条件除了温度、pH等外，发酵培养方式对目标产物的产量有较大影响。本研究考察了静置培养、振荡培养及两者结合培养的方式对红色素产生的影响，结果见表1。第1组发酵瓶置于30 ℃恒温静置培养箱培养；第2组发酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒温振荡培养箱培养一段时间，再将其置于30 ℃的恒温静置培养箱培养一段时间；第3组发酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒温振荡培养箱内连续培养。三种操作发酵时间相同。结果表明，第2组的分段发酵方式最利于产红色素。

表1 不同发酵培养方式对红色素产生的影响

2.6 培养时间对产红色素的影响

前期实验表明振荡培养明显有利于真菌快速生长，但持续的振荡培养并不能增加红色素产量。因此，进一步对发酵振荡时间对产红色素的影响进行了研究，结果见图5，在振荡时间为35 h到41 h之间时随振荡培养时间增加，红色素产量也增加，而后继续振荡培养红色素产量出现下降，这表明红色素的产生和菌体生长并非同步。

图 5 振荡时间对发酵产红色素的影响

3 讨论

本研究对单独培养青霉菌株发酵产红色素的条件行实验，考察装量、接种量、培养时间、培养条件等参数对红色素产量的影响。实验结果表明：500 mL锥形瓶中装入300 mL初始pH酸碱度为6.0的液体发酵培养基，接种浓度为1.5×107个/mL分生孢子悬液1 mL，发酵瓶置于30 ℃、160 r/min的恒温振荡培养箱内41 h，再将其置于30 ℃的恒温静置培养箱内培养一段时间，产红色素量最高。