络合滴定法测定复方钾钙镁溶液中氯化钙含量的方法学验证与不确定度分析

付 晖，李 想，韩 蓓，王雪莉，姚 瑛，胡 琴，张 喆

(北京市药品检验所， 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206)

在药品质量标准研究制定的过程中，方法学验证能够考查所建立的质量控制方法的可靠性和有效性[1]；对方法不确定度的研究能够找到实验过程中影响实验的关键因素[2-5]。二者相结合，可以更全面地对所建立的方法进行验证与考量。容量分析具有简便、快捷的特点，可用于测定多种物质的含量，并且有足够的准确度，因而广泛应用于医院制剂的分析检验中。络合滴定法是以络合反应为基础的容量分析方法。其中，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)滴定法的应用最为广泛。复方钾钙镁溶液用于心脏直视手术前的心脏停搏，复方制剂中的钾、钙与镁可以通过阻滞钠的内流诱导心肌细胞膜过度极化，从而导致心脏停搏，制剂中各组分的含量是药物的关键质量属性[6]。本研究对络合滴定法测定复方钾钙镁溶液中氯化钙含量测定的方法进行方法学验证与不确定度分析。采用EDTA滴定液0.05 mol/L滴定样品中氯化钙的含量，验证方法的准确度、精密度、范围与线性；通过绘制样品的分析测定流程图，确定不确定度的来源，计算方法的不确定度。本研究可为复方钾钙镁溶液及其同类产品的质量控制与质量标准研究制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器

经计量校准的10 ml(分度值0.05 ml)与50 ml(分度值0.1 ml)滴定管(天津玻璃厂)；Seven Compact型pH计，XA205型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 药品与试剂

复方钾钙镁溶液[中国医学科学院阜外心血管病医院，批号：G1701031，规格：10ml，含氯化钙(CaCl2·2H2O)1.38%～1.52%(g/ml)，含氯化镁15.44%～17.06%(g/ml)，含盐酸普鲁卡因0.65%～0.71%(g/ml)，含氯化钾3.54%～3.91%(g/ml)，含氯化钙为1.38%～1.52%(g/ml)]；氯化钙(美国药典标准品，批号：F0D153，纯度：101.9%)，基准氧化锌(北京化工厂，批号：20150327，纯度：99.95%～100.05%)；氯化镁、氯化钾、EDTA、氢氧化钠、盐酸、乙醇、氨水、氯化铵、甲基红、铬黑T与钙紫红素均为分析纯；实验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 氯化钙含量测定

精密量取样品2 ml，加水10 ml，氢氧化钠试液5 ml，钙紫红素指示剂约0.1 g，摇匀，用EDTA滴定液(0.05 mol/L)滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色。每1 ml的EDTA滴定液(0.05 mol/L)相当于7.351 mg的CaCl2·2H2O(测定过程中使用的滴定液实际浓度为0.050 06 mol/L)。

2.2 EDTA滴定液的标定

取于约800 ℃灼烧至恒质量的基准氧化锌0.12 g，精密称定，加稀盐酸3 ml使溶解，加水25 ml，加0.025%甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25 ml与氨-氯化铵缓冲液(pH=10.0)10 ml，再加铬黑T指示剂少量，用EDTA滴定液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 ml的EDTA滴定液(0.05 mol/L)相当于4.069 mg的氧化锌。根据EDTA滴定液的消耗量与氧化锌的取用量，算出EDTA滴定液的浓度。

2.3 回收率试验

精密称量氯化钙0.023、0.029及0.035 g各3份，分别加空白液2 ml(其中含氯化钾0.740 g、氯化镁0.325 g与盐酸普鲁卡因0.014 g)和水8 ml，加氢氧化钠试液5 ml，钙紫红素指示剂约0.1 g，用EDTA滴定液(0.05 mol/L)滴定至溶液由紫红色转变为纯蓝色。

2.4 试液与指示剂

按《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)规定的方法配制[1]。

2.5 方法学验证

络合滴定法测定复方钾钙镁溶液中氯化钙含量的方法学验证结果显示[7]，氯化钙浓度0.011 6～0.017 4 g/ml的范围内时，样品消耗滴定液的体积与氯化钙浓度呈良好的线性关系，线性方程为Y=272.07X(R=1.00)。方法的回收率在99.54%～100.10%之间,平均回收率为99.91%。取复方钾钙镁溶液样品，按“2.1”—“2.4”项下测定方法平行测定氯化钙含量6份，滴定平均消耗滴定液4.10 ml，测定结果平均值为1.51%(g/ml)，方法的精密度为0.39%。

2.6 不确定度数学模型

2.6.1 氯化钙的测定：按公式(1)计算氯化钙的含量。公式(1)，X=(V1×T×C)/(V2×0.005×1 000)×100%。式中，V1(ml)为消耗滴定液体积；T为滴定度[氯化钾的摩尔质量(MCaCl2)为147.01]7.351 mg/ml；C(mol/L)为EDTA滴定液实际浓度；V2(ml)为样品取样体积；0.005(mol/L)为EDTA滴定液标准浓度；1 000为单位换算系数，将mg转换为g。

2.6.2 EDTA滴定液的标定：按公式(2)计算的EDTA滴定液的浓度。公式(2)，C=(m×p×1 000)/[(V1-V0)×MZnO]×100%。式中：m(g)为氧化锌取样量；P(%)为氧化锌纯度；V1(ml)为样品消耗滴定液体积；V0(ml)为空白消耗滴定液体积；MZnO(g/mol)为氧化锌摩尔质量为81.38；1 000为单位换算系数，将ml转换为L。

2.7 不确定度来源的识别

计算公式(1)中所包含的主要参数为消耗滴定液体积(V1)、滴定液实际浓度(C)、样品的取样体积(V2)、CaCl2的摩尔质量(M)与实验操作的重复性(R)。在不确定度计算过程中，滴定液实际浓度(C)的相对标准不确定度计算需包含公式(2)中的主要参数。方法的回收率(F)带来的的影响也应作为分量引入。不确定度来源因果分析图见图1。

图1 不确定度来源分析图Fig 1 Analysis chart of the source of uncertainty

2.8 不确定度的量化

表1 氯化钙的原子量及其不确定度Tab 1 Atomic weight and its uncertainty of calcium chloride

2.8.6 EDTA滴定液实际浓度引入的相对标准不确定度U(C)：计算公式(2)中所包含的主要参数为称取氧化锌(m)、氧化锌纯度(P)、消耗滴定液体积(V1)、氧化锌的摩尔质量(M)与实验操作的重复性(R)。实验重复标定EDTA滴定液8次，平均消耗滴定液体积为29.54 ml，最终标定结果为0.050 06 mol/L，标准偏差为0.000 014 08 mol/L。

(5)空白消耗滴定液体积：空白结果为0 ml，忽略该项。

表2 氧化锌的原子量及其不确定度Tab 2 Atomic weight and its uncertainty of zinc oxide

表3 不确定度来源及结果分析Tab 3 Analysis on the sources and results of uncertainty

3 讨论

本品为复方钾钙镁溶液，采用络合滴定法测定供试品中氯化钙与氯化镁的含量，需要先控制供试品溶液的pH>12.5，先以Mg(OH)2沉淀掩蔽法测定钙的含量。然后在pH≈10的条件下，测定钙、镁的总量，通过差减法计算镁的含量。在pH>12.5的条件下，一方面滴定的配位反应的副反应系数较小，另一方面可以保证Mg(OH)2沉淀完全[15]。有观点认为，Mg(OH)2沉淀的吸附作用会给钙的测定带来误差，而这种误差又会传递到镁上[16-17]。鉴于此，本研究对采用络合滴定法测定氯化镁的含量测定方法进行了方法学验证。

本研究中，当氯化镁质量浓度在0.130 0～0.195 0 g/ml的范围内时，样品消耗滴定液的体积与氯化镁浓度呈良好的线性关系，方法的回收率在99.58%～100.1%之间, 平均回收率为99.82%，方法的精密度为0.26%，采用络合滴定法可以准确测定复方钾钙镁溶液中氯化钙与氯化镁的含量。由不确定度评定结果可知，滴定液消耗体积的不确定度分量是最大的。方法消耗滴定液体积为4.10 ml，适量增加样品取样量，或者适量减小滴定液的浓度，从而增加消耗滴定液的体积，可以减小方法的不确定度。

总之，采用络合滴定法测定复方钾钙镁溶液中氯化钙的含量，该方法有良好的准确度与精密度；复方钾钙镁溶液中氯化钙的质量分数为1.51%，其扩展的不确定度为0.027 4%(k=2)；方法的不确定度主要来源于消耗滴定液的体积数量，适量增加样品取样量，或者适量减小滴定液的浓度，从而增加消耗滴定液的体积，可以减小方法的不确定度。本研究可以为复方钾钙镁溶液及其同类产品含量测定的质量标准制定提供参考。