宋晓莹,陈兰珍,2,3*,李 熠,2,3,周金慧,2,3,陈 雷,辛曼曼
(1.中国农业科学院 蜜蜂研究所,北京 100093;2.农业农村部 蜂产品质量安全控制重点实验室,北京 100093;3.农业农村部 蜂产品质量安全风险评估实验室,北京 100093;4.中国科学院武汉物理与数学研究所,湖北 武汉 430071)
蜂蜜的物质组成复杂,其主要成分是糖类,占蜂蜜成分的65%~80%,糖类中又以葡萄糖和果糖为主。此外,还有18%~22%的水,少量的蛋白质、酶、游离氨基酸、黄酮类物质、酚酸类物质、矿物元素以及微量元素[1]。常见的蜂蜜品种是按照蜜蜂所采集的蜜源植物不同进行划分。我国地域辽阔,蜜源植物种类较多,能得到的商品蜜种类多达几十种。因此,还衍生出其他划分蜂蜜品种的方式,如根据蜂蜜的颜色可划分为浅色蜜和深色蜜,市面上常见的洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜、椴树蜜为浅色蜜,枣花蜜、荞麦蜜为深色蜜。
蜂蜜作为一种药食同源的食品,近年来的市场需求量不断增加。由于不同蜜源植物来源的蜂蜜品质及感官特征不同[2],因此在市场中,不同品种蜂蜜的价格差异较大,且以浅色蜜更受欢迎[3]。但不同种蜂蜜的主要成分含量差别很小,传统方法很难鉴别蜂蜜品种,因此出现了低价蜜掺入高价蜜中进行销售的现象,造成蜂蜜品种标识混淆,市场价格混乱[4],并已成为蜂蜜市场中一个比较突出的问题。
蜂蜜品种的传统检测方法是感官鉴别和花粉分析,其结果判断带有一定的主观性,需要实验员具有丰富的经验和专业的知识背景[5-6]。近年,一些检测技术也被应用于蜂蜜品种鉴别中,主要包括高效液相色谱[7]、液相色谱-质谱联用技术[8]、气相色谱-质谱联用技术[9]、光谱技术(如近红外光谱、中红外光谱、拉曼光谱、荧光光谱)[10-13]、电感耦合等离子体质谱[14]等。这些方法均有各自的优缺点,尚未有一种检测技术能够有效地鉴别不同品种的蜂蜜。
氢核磁共振技术(1H NMR)是依靠核磁共振现象测定分子结构的一种谱学技术,通过对样本施加外加磁场,使处在低能态的自旋核发生跃迁到高能态,当自旋核发生弛豫返回低能态时,产生核磁共振信号[15]。该技术一次进样就可检出样品中所有含氢的化合物,检测物质的覆盖面广,样本预处理简单,上机分析所需时间较短。近年来,1H NMR被广泛应用到食品领域,并在牛奶[16]、橄榄油[17]、酒类[18]的品种鉴别以及咖啡[19]、牛奶[20]的产地识别中取得了很好的成果。现阶段,该方法在蜂蜜品种鉴别领域中的应用较少。本研究采用1H NMR对洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜进行全谱图分析,结合化学计量学的方法,以期从整体物质角度,建立最佳的判别分析模型,从而为解决蜂蜜品种的鉴别提供行之有效的方法。
AVANCE 600MHz液体NMR仪(瑞士 Bruker 公司);PL103电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司):移液枪(德国 Eppendorf 公司);1-15PK台式高速离心机(德国 Sigma 公司);5 mm 核磁管(美国 Norell 公司);涡旋混合器(美国 Scientific Industries 公司)。
三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)购自上海国药集团试剂有限公司;重水(D2O,99.9%氘代,含0.05 g/100 mL 2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸(TSP),美国 Cambridge Isotope Laboratories公司)。
实验选择的蜂蜜品种为洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜,均为较受市场欢迎的浅色蜜。所有的蜂蜜样品均直接取自蜂场中自然酿造的成熟蜜。共收集144个样品,在4 ℃的冰箱中贮藏、备用。蜂蜜样本的具体信息如表1所示。
表1 蜂蜜样本的信息Table 1 The information of honey samples
将蜂蜜从冰箱中取出,放置至室温。对有结晶的样品,在60 ℃水浴加热,待样品完全溶解后再称样。称取蜂蜜100.00 mg置于离心管中,加入1.2 mL pH 7.4的磷酸缓冲液(0.15 mol/L K2HPO4/ NaH2PO4,使用含10% D2O 的双蒸水配制而成)后,在涡旋振荡器上振荡5 min,直至样品混合均匀。在8 000 r/min下离心10 min,取600 μL上清液转至5 mm 核磁管中。
在600 MHz液体NMR仪上,采用NOESYPR1D脉冲序列(Recycle delay-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition)采集样品信息,序列中90°脉冲的脉宽为14.5 μs,固定间隔t1为4 μs,混合时间tm为2.27 s,实验温度设置为298 K。采用预饱和方法进行水峰抑制,持续2.0 s。1H NMR的谱宽设为 12 000 Hz,采样点数为32 768,信号累加次数为64次。所有得到的自由感应衰减信号经过指数加权和傅里叶变化(指数线宽因子为0.3 Hz)后得到核磁共振的一维图谱。
对得到的1H NMR谱图进行处理,手动调节基线、相位,对化学位移定标,将内标TSP的共振峰设为δ0.00。将处理好的NMR谱图按照每段宽度为δ0.004进行分段积分,为消除残留水信号的影响,剔除δ4.73~4.93区间的信号。为减少不同组分和样品间的差异,对信号峰的峰面积进行归一化处理,所得到的积分数据导入Excel文件中保存。采用SIMCA 13.0 软件(v13.0,Umetrics.,Sweden)进行数据分析。
图1 洋槐蜜(A)、油菜蜜(R)、荔枝蜜(L)的1H NMR谱图Fig.1 1H NMR spectra of acacia honey(A),rape honey(R) and lychee honey(L)1.formic acid(甲酸),2.phenylalanine(苯丙氨酸), 3.tyrosine(酪氨酸),4.kojibiose(曲二糖), 5.sucrose(蔗糖),6.nigerose(黑曲霉糖), 7.turanose(松二糖),8.α-glucose(α-葡萄糖),9.citric acid(柠檬酸),10.succinic acid(琥珀酸),11.proline(脯氨酸), 12.acetic acid(乙酸),13.alanine(丙氨酸),14.lactic acid(乳酸), 15.3-hydroxy-butanone(3-羟基丁酮),16.ethyl acetate(乙酸乙酯), 17.ethanol(乙醇),18.2,3-bu-tandiol(2,3-丁二醇), 19.valine(缬氨酸)
选取洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜的核磁谱图进行对比,发现不同品种蜂蜜的谱图无明显差异。蜂蜜的1H NMR 谱图可以分为3部分:脂肪区(δ0.0~3.0),糖类化合物区(δ3.0~6.0),芳香区(δ6.0~9.5)。通过局部放大3个区域的主要信号峰区间(图1),对其中的信号峰进行鉴别,并结合化学位移、耦合常数、峰形等信息,查阅相关参考文献对信号峰进行归属后,共鉴定出19种化合物[21-23]。
在脂肪区主要集中有机酸、氨基酸以及醇类物质的信号峰。在糖类化合物区域,有效信号主要集中在δ5.0~5.5,集中着单糖和二糖信号。在芳香区中,可鉴别出苯丙氨酸、酪氨酸、甲酸3种物质中苯环上氢质子的共振信号。
在蜂蜜中,葡萄糖、果糖等单糖含量较高,与丙氨酸等含量低的物质在含量上可以相差数个数量级,因此在后续进行多变量统计分析时,信号较弱的成分含量变化会被信号较强的成分含量变化所掩盖,进而影响差异成分的识别。为了避免上述情况出现,在建模前需对数据进行优化。常见的数据预处理方法包括:中心化(Mean center scaling,Ctr)、自标度化(Unit variance scaling,UV)、帕莱托标准化(Pareto scaling,Par)。Ctr 处理是将数据集中的各项数据减去其均值,既不会改变样本点之间的相对位置,也不会促使变量间相关性发生改变,能够更好地分析数据集中波动的部分,但可能导致低含量的变量信息受到高含量变量信息的抑制[24]。UV处理可使新得到的每个变量的均值或标准差在同一个等级上,但噪声信号区域可能会影响最终结果[25]。在Par处理中,中心化和尺度变化同时进行,通过对每个变量赋予相同的缩放系数,可有效地减少较大信号数据的相对重要性,保留原始数据集结构的完整性,但变化相对较小的重要变量无法被选定为标记物[26]。因此,3种方法各有优缺点,在实际分析中需根据具体的数据进行筛选。
在SMICA软件中,常见的评价模型质量的参数有R2X、R2Y和Q2,其中R2X、R2Y分别代表模型对数据矩阵的解释能力,Q2代表模型整体的预测能力。通常情况下,R2和Q2值越接近1,则说明模越稳定可靠,该值大于0.5就证明模型的判别效果较好。
表2 PLS-DA模型在不同数据预处理下的模型参数Table 2 Model parameters of PLS-DA model under different data scaling methods
图2 PLS-DA在UV预处理下的得分散点图Fig.2 Score scatter plot of PLS-DA with UV scaling
MethodR2X(cum)R2Y(cum)Q2(cum)Ctr0.7690.5260.471UV0.6320.9580.905Par0.6850.6940.607
图3 OPLS-DA在UV预处理下的得分散点图Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA with UV scaling
2.2.1偏最小二乘判别分析偏最小二乘判别分析(PLS-DA)是一种常见的有监督的模式识别方法,是在主成分分析的基础上增加了一个隐形变量(Y),使自变量向Y回归的程度达到最大,以此弱化组内之间的差异,突出组间的差异[27]。
分别在3种预处理条件下建立PLS-DA模型,3个模型中的参数见表2。通过参数对比,发现在UV模式下模型的判别效果最好。在此条件下建立PLS-DA模型,该模型中前8个主成分的累积贡献率R2Y已近95%,超过一般要求的累积贡献率(85%)。根据模型的得分散点图(图2)可看出,荔枝蜜样本主要集中在PC1得分值的负值区域,而洋槐蜜、油菜蜜样本主要集中在PC1得分值的正值区域;油菜蜜样本主要集中在PC2得分值的正值区域,洋槐蜜样本主要集中在PC2得分值的负值区域。3种蜂蜜之间有着明显的分离趋势,但仍然存在过重合的现象,需选择更为合适的判别模型。
2.2.2正交偏最小二乘判别分析为了进一步去除不相关的差异,更好地进行判别分离,在PLS-DA 基础上结合正交信号,去除与Y矩阵无关的X矩阵的变化,使得X矩阵和Y矩阵之间的关系最大化,将分组差异最大化[28]。因此,采用正交偏最小二乘判别法(OPLS-DA法)进一步分析、比较不同品种蜂蜜之间的差异。
分别在3种预处理条件下建立OPLS-DA模型,通过对比同模型的特征参数值(表3),发现在UV模式下,模型的R2Y和Q2值均最高,因此选择UV作为建模时的数据预处理方式。根据OPLS-DA模型得分图(图3),发现在第二主成分下,3种蜂蜜可以得到很好的判别分离,油菜蜜主要集中在PC2得分值的正值区域,荔枝蜜处在坐标的中心区域,而洋槐蜜主要分布在PC2得分值的负值区域。
利用OPLS-DA模型可以有效地区分洋槐蜜、油菜蜜和荔枝蜜,所建模型对3种蜂蜜的判别解释能力达95.8%,对未知样本的预测能力为90.5%。
本文采用1H NMR结合化学计量学的方法进行蜂蜜品种的鉴别。通过对不同品种蜂蜜的主要核磁信号峰进行归属,共鉴定出19种化合物的特征峰。为了更好地挖掘核磁数据中的信息,讨论了在建立判别模型中数据预处理的方法,通过比较发现自标度化为最适合核磁数据建模的数据预处理方式。通过不断筛选合适的数据分析模型,发现在自标度化处理下,利用OPLS-DA模型可以很好地区分洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜。本文所采用的1H NMR是基于蜂蜜的全组分分析方法,能够获得样品的全部有效信息,有效弥补了其他检测技术对检出物质化学键、官能团的限制。将1H NMR与OPLS-DA相结合,能够快速、准确地区分不同品种的蜂蜜,从而为规范蜂蜜市场提供了一种新方法。