酶脱支处理对颗粒态缓慢消化淀粉形成的影响

赵 凯，陈 威，宫玉晶，刘 宁，陈凤莲，杨春华

(哈尔滨商业大学 食品科学与工程省级重点实验室， 黑龙江 哈尔滨 150076)

淀粉按消化性不同可以分为快速消化、缓慢消化及抗消化3种类型。其中缓慢消化淀粉(slowly digestible starch, SDS)一般定义为可在小肠中完全消化吸收但速度较慢的淀粉[1]。SDS因其消化吸收速度较慢，从而具有较好的功能特性，如调节血糖、血脂、控制体重、预防结肠癌及能量逐步释放等[2-3]，可应用于低热量食品及耐力食品的开发。

缓慢消化淀粉的制备方法主要有4种，分别为物理改性、酶脱支改性、化学改性以及复合改性；其中多以物理方法和酶方法为首选。物理方法主要包括韧化处理、湿热处理、压热处理等；酶方法主要包括α-淀粉酶处理和普鲁兰酶处理[4]。在以上4种制备方法中，目前国内外主要集中于对淀粉进行单一的物理或酶法改性制备SDS，除了热处理(韧化及湿热处理)等物理方法制备的SDS属于颗粒态外[5-6]，其他过量水分条件下的压热处理、糊化后酶脱支处理制备的SDS均为非颗粒态[4,7-8]。而颗粒态的SDS容易对其进行分离、纯化、脱水、干燥及粉碎等后处理，便于食品、制药等行业的进一步应用。

文章以玉米淀粉为主要原料，研究低于糊化温度下的酶脱支处理对淀粉性质的影响，在对处理过程中典型条件产物进行结晶结构、热焓特性、颗粒特性分析的基础上，揭示在低于糊化温度条件下酶脱支处理对直链淀粉溶出及SDS形成的影响。通过对上述过程的控制，调控SDS的制备过程，为其进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉，黑龙江龙凤玉米开发有限公司；猪胰α-淀粉酶(12U/g)，美国Sigma公司；葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸钠、盐酸、碘、碘化钾、氢氧化钾等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DSC4000型差示扫描量热仪，美国Perkin Elmer公司； DF- 101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州市亚荣仪器有限公司；TDL- 5- A型离心机，上海安亭科学仪器厂；DHG- 9420A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；FW80- I型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；S- 3400N型扫描电子显微镜，日本Hitachi公司。

1.3 实验方法

1.3.1直链淀粉含量的测定

直链淀粉含量测定参照GB/T 15683—2008[9]。

1.3.2酶脱支处理淀粉的制备

将玉米淀粉配制成质量浓度为0.05～0.06 g/mL(干基)的淀粉乳，密封，在温度为35～50 ℃时水浴加热，调节pH值到4.6，加入普鲁兰酶10～60 ASPU/g，恒温振荡6～14 h，离心，得到上清液和沉淀，制备不同直链淀粉溶出量的酶脱支处理淀粉，相应的直链淀粉溶出量分别为10.15、28.89、36.51、44.83、55.57、61.67、72.99、82.93、140.85 mg。

1.3.3缓慢消化淀粉含量的测定

以Guraya法为参考，优化改进[10-11]。

1.3.4淀粉颗粒形貌观察

使用扫描电子显微镜SEM，用双面胶将干燥的待测样品固定在铝制的样品台上，然后采用离子溅射法在样品表面镀上一层均匀的金箔，将其保存在干燥器中。将样品置于扫描电子显微镜中进行测试观察。具体测试条件如下：工作电压5 kV，放大倍数2 000倍和5 000倍[12]。

1.3.5淀粉颗粒结晶特性分析

将实验样品前处理去除其中的快速消化淀粉，然后充分研磨，过筛。测试前将样品在室温、相对湿度为100% 的条件下静置平衡24 h，然后采用X-射线衍射仪测试样品的结晶结构。起始角度5°，终止角度40°，特征射线Cu，电压40 kV，电流30 mA，扫描速度3°/min，时间常数1 s[13]。

1.3.6淀粉颗粒热焓特性分析

称取样品(2.5±0.5)mg置于铝坩埚中，样品与去离子水的质量比为1∶2并混匀，室温下平衡2 h，以空皿为参比，从30 ℃加热到100 ℃，加热速率10 ℃/min，用差示扫描量热法(DSC)分别测定起始温度To、峰值温度Tp、终止温度Tc及焓值ΔH的变化情况[13]。

1.3.7溶出直链淀粉含量与SDS含量相关性分析

实验数据采用SPSS 17.0软件处理，并采用Origin 8.5软件绘图。

1.3.8数据分析

实验数据采用SPSS 17.0和JADE 6.0软件处理，并采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 酶脱支处理淀粉的颗粒形貌

酶脱支前后淀粉颗粒形貌见图1。按直链淀粉溶出量依次增加的顺序(1～4号，其直链淀粉溶出量分别为28.89、36.51、61.67、140.85 mg)从酶脱支处理后的淀粉中分别选取不同的淀粉样品。由图1(a)和图1(b)可以看出，玉米淀粉颗粒呈现圆形和多角形，表面光滑，棱角分明，颗粒表面没有腐蚀和损伤的现象，结构完整。由图1(c)～图1(j)可以看出，与原淀粉相比，经过低于糊化温度的酶脱支处理后，淀粉颗粒大小变化不大，但颗粒表面发生了非常明显的变化，部分淀粉颗粒的表面变得粗糙，出现不同程度的凹陷与侵蚀，说明酶脱支处理对淀粉的破坏是从淀粉颗粒表面向内部进行的。随着直链淀粉溶出量的增加，淀粉颗粒被破坏的程度也显著增大，淀粉颗粒表面变化更为明显，颗粒表面有孔洞出现。总体看，酶脱支处理淀粉后，淀粉颗粒形态仍保持原来的多角形，与原淀粉基本一致；但是由于在酶脱支过程中水分及普鲁兰酶向淀粉颗粒内部渗透，酶切断α-1,6-糖苷键，对支链淀粉，尤其是表层的支链淀粉进行局部脱支，淀粉颗粒出现一定程度的损伤。颗粒表面的粗糙、裂痕、孔洞是由于酶脱支处理后分子内部断裂的分子链随水溶物流失造成的。由此表明，低于糊化温度条件下的酶脱支处理提高了淀粉颗粒表面的疏松度。

图1 酶脱支前后淀粉颗粒形貌Fig.1 Granule morphology of starches

2.2 酶脱支处理后直链淀粉溶出量对缓慢消化淀粉含量的影响

酶脱支处理后淀粉样品的SDS含量不同，见图2。玉米淀粉原淀粉的SDS含量最低；经过普鲁兰酶脱支处理的淀粉的SDS含量较原淀粉均有所增加。SDS增多的原因主要是酶脱支处理时淀粉颗粒同时与水和普鲁兰酶接触，酶首先作用于淀粉颗粒的无定形区，提高了无定形区的流动性，然后与结晶区接触，普鲁兰酶切断支链淀粉的α-1,6-糖苷键，使支链大分子变小，加大了淀粉分子链间的距离，使淀粉部分结晶区间的缔合减弱，直链淀粉溶出。后期冷却过程中，淀粉分子链间的双螺旋结构重新形成堆积，导致消化速率减慢，SDS含量增加；而过量直链淀粉溶出，使结晶结构更为致密，可能会提高抗性淀粉含量，降低SDS含量。由图2可知，在较低直链淀粉溶出量(10.15 mg)时，SDS的含量稍高于中等溶出量(25～45 mg)，但是低于较高溶出量(50～80 mg)。原因可能是直链淀粉在刚开始从颗粒内溶出时，由于溶出量较小，部分脱支后的直链淀粉保留在颗粒内，在热处理的条件下，颗粒膨胀，内部空间增大，直链淀粉与支链淀粉相互缠绕，后续冷却过程中参与结晶调整，形成不完全结晶，导致消化速率降低，SDS含量提高[10]；Hoover等[14]在研究马铃薯淀粉脂质复合物时发现，对淀粉进行热处理时，溶出的直链淀粉会缠绕在颗粒表面，抑制膨胀，提高颗粒的刚性，这也可能是低直链淀粉溶出量时SDS含量提高的一个原因。该过程与充分糊化后脱支处理的SDS形成过程及机制不同，大米淀粉、蜡质玉米淀粉、高粱淀粉等谷物淀粉糊化后进行酶脱支处理也会形成SDS，但在该过程中上述淀粉的结晶类型会由A型转化为B型，可能是由于后续冷藏过程形成了不完善的B型结晶结构，其堆积紧密度较低，从而增强对酶的抵抗作用，促进SDS的形成[10-12]。

图2 直链淀粉溶出量对缓慢消化淀粉含量的影响Fig.2 Effect of amylose leaching on content of slowly digestion starch

2.3 酶脱支处理后直链淀粉溶出量与缓慢消化淀粉形成的相关性分析

酶脱支处理后直链淀粉溶出量与缓慢消化淀粉形成量具有一定的关系，且随着溶出的直链淀粉增加，缓慢消化淀粉出现先增加后减少的趋势，见图3。由图3分析可知其符合方程Y=-0.005 1X2+0.855 4X-5.451 2，R2=0.933 4；相关系数|R|=0.966 1，且0.75<0.966 1<1，所以变量间的相关性很强，拟合较好。出现上述结果，可能是由于淀粉颗粒中直链淀粉溶出，且经过普鲁兰酶脱支处理使淀粉样品含有更多的短链，通过氢键和疏水作用，使双螺旋结构改变，原有的晶体生长方向和晶体间的相互作用发生变化，提高结晶完善度以抵抗酶解作用；另外冷却后颗粒内剩余的直链淀粉缠绕结合，阻碍胰淀粉酶的作用；由DSC结果可知，相变的起始温度、峰值温度、终止温度均有所增加，糊化变得不易，也说明分子的稳定性增强，相应的缓慢消化淀粉的量也有所增加；而随着直链淀粉溶出量的增加，淀粉颗粒的破坏程度变大，颗粒的结晶结构更加紧密，对淀粉酶抵抗作用增强，导致缓慢消化淀粉的量有所下降。

图3 直链淀粉溶出量与缓慢消化淀粉形成量的关系Fig.3 Correlation between amylose leaching and slowly digestion starch formation

2.4 酶脱支处理淀粉的结晶特性

玉米原淀粉和不同酶脱支处理淀粉的X-射线衍射图见图4，可以看出淀粉经过酶脱支改性后，X-射线衍射图谱并没有发生明显的变化。玉米原淀粉及去除快速消化淀粉的酶脱支处理淀粉仍然属于A型结构[15]。从结晶度看，原淀粉的结晶度为37.15%，1～4号酶脱支处理淀粉结晶度分别为32.02%、31.91%、29.40%、27.61%。相对结晶度降低，并且随着直链淀粉溶出量的增大而显著降低。结晶度降低，可能是由于淀粉在低于糊化温度条件下进行酶脱支处理，淀粉依然保持颗粒状态，适度溶胀，使直链淀粉及部分小分子的支链淀粉溶出；同时酶处理使部分支链淀粉侧链断裂，导致直链淀粉和支链淀粉的比例有所改变，部分淀粉链分子重新排列，从而带来结晶度的变化。相对于结晶的数量，结晶的质量对淀粉消化性影响更大。

0号为原淀粉，1～4号为酶脱支处理淀粉，其直链淀粉溶出量分别为：28.89、36.51、61.67、140.85 mg。图4 淀粉酶脱支前后的X-射线衍射结果Fig.4 X-ray diffraction pattern of starches before and after debranching

2.5 酶脱支处理淀粉的热焓特性

0号为原淀粉，1～4号为酶脱支处理淀粉，其直链淀粉溶出量分别为：28.89、36.51、61.67、140.85 mg。图5 淀粉改性前后DSC分析Fig.5 DSC spectrum parameters of starch

原淀粉和酶脱支处理后的淀粉样品的DSC分析如图5及表1，酶脱支处理后淀粉的糊化起始温度和峰值温度均有显著差异，但糊化终止温度和糊化焓变化不大。玉米原淀粉的相变起始温度为62.52 ℃，与玉米原淀粉相比，淀粉经过未糊化的酶脱支处理后的相变起始温度明显增加，且随着直链淀粉溶出量的提高，起始温度有增加趋势，主要是由于酶脱支处理后，支链淀粉的侧链被破坏，淀粉的双螺旋结构重新形成，使其分子的稳定性增强，相变的起始温度升高；另外酶脱支处理是在低于糊化温度条件下进行的，兼具对淀粉的韧化处理作用，Hoover和Vasanthan推测韧化处理过程中相变峰向高温推移，是由于直链淀粉与支链淀粉外链作用的结果[16]，脱支处理后形成较多短直链淀粉，一部分溶出，另一部分会与剩余的支链淀粉侧链交缠，从而导致相变温度提高。Tc-To减小，糊化峰变窄可能是由结晶结构更紧密造成的，Chung等[17]对玉米及豌豆淀粉进行韧化处理时，也得到类似结果。根据X-射线衍射结果可知，结晶度降低，这也充分说明结晶质量对消化性影响较大。糊化焓有所下降，表示糊化过程中解开双螺旋结构的能量减少。

表1 酶脱支淀粉的DSC图谱参数

0号为原淀粉，1～4号为酶脱支处理淀粉，其链淀粉溶出量分别为： 28.89、36.51、61.67、140.85 mg。Tc-To表示淀粉的相转温程；ΔH表示糊化焓。数据表示为平均值±标准偏差(n=3)，同列肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

3 结 论

低于糊化温度酶脱支处理淀粉的扫描电镜分析结果表明，经过酶脱支处理后，淀粉颗粒大小变化不大，但颗粒表面发生了非常明显的变化，部分淀粉颗粒的表面变得粗糙，棱角明显，出现不同程度的凹陷。由此表明，在低于糊化温度下通过酶脱支制备缓慢消化淀粉能提高淀粉颗粒表面的疏松度。

X-射线衍射结果表明：玉米原淀粉在15.274°、17.203°、18.108°和23.186°处有明显的特征峰出现，属于典型的A型结构。淀粉经过低于糊化温度酶脱支处理后，结晶类型仍然为A型，但结晶度下降。说明酶脱支处理淀粉对其消化速率的影响主要是其结晶结构的调整，相对于结晶的数量，结晶的质量对淀粉消化性影响更大。

DSC分析结果表明，淀粉经酶脱支处理后，淀粉糊化的起始温度、峰值温度、终止温度均有所增加，相转变温度区间变小，但糊化焓变化不大。说明淀粉的结晶结构变得紧密，导致其消化速率减慢。