加味柴芍六君颗粒对便秘型肠易激综合征模型大鼠结肠组织5-HT的影响

郑超伟，李桂贤，李 敏，覃钊兰

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

肠易激综合征（IBS）是一种功能性肠病，表现为反复发作的腹痛，与排便相关或伴随排便习惯改变。典型的排便习惯异常可表现为便秘、腹泻，或便秘与腹泻交替，同时可有腹胀／腹部膨胀的症状[1]。便秘型肠易激综合征（IBS-C）是其中的一个亚型，其病理生理学基础主要是胃肠动力学异常和内脏感觉异常，表现为独立的肠功能紊乱性疾病，其特征是肠道壁无器质性病变，但整个肠道对刺激的生理反应有过度或反常现象[2]。IBS-C的病因和发病机制尚不清楚，可能与多种因素有关。研究表明5-羟色胺（5-HT）作为神经递质，其表达的升高与IBS-C的发生有重要关系[3]。加味柴芍六君颗粒为我院名老中医李桂贤教授治疗IBS-C的基本方，效果显著。本实验旨在研究加味柴芍六君颗粒对大鼠结肠组织中5-HT表达的影响，以探讨其对IBS-C治疗的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级♂SD大鼠72只，体质量（180±20）g，由广西中医药研究所实验动物中心提供。每只大鼠分笼独立饲养，正常饲食、饮水，12h／12h昼夜交替。

1.2 实验药物

加味柴芍六君颗粒（柴胡10g，白芍15g，陈皮6g，法半夏10g，太子参10g，白术15g，苏梗10g，牛膝15g，枳实15g，麻子仁15g，甘草6g）用江苏省江阴天江药业有限公司生产的免煎中药，由我院制剂室配制成浓度为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的加味柴芍六君颗粒溶液。

枸橼酸莫沙必利分散片（成都康弘药业集团有限公司生产，国药准字H20031110，规格5mg），成人每日常用量为15mg，相当于大鼠1.5mg/kg。

半固体营养糊的制备，取羧甲基纤维素5g溶于125mL蒸馏水中，并分别加入奶粉8g，白糖、淀粉各4g，活性炭末2g，搅拌均匀后配制成约150mL（约1g/mL）的黑色半固体糊状物。

2 方 法

动物模型的建立。适应性喂养3天后，将72只大鼠随机分为正常组，模型组，加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量组及莫沙必利组各12只。除正常组外其余各组均用冰水灌胃法建立便秘型肠易激综合征大鼠模型[4]。每只大鼠均用代谢笼分笼独立饲养，正常饲食、饮水，12h/12h昼夜交替。模型组给予冰水（0℃～4℃生理盐水）2mL，1日1次灌胃，共14天。正常组不灌胃，正常饲食、饮水。其余各组除冰水灌胃外也给予正常饲食、饮水。为消除生物节律的影响，均于上午8∶00开始灌胃，停止灌胃后各组继续正常饲食、饮水。共14天。

给药方法。造模成功后第2天开始给药治疗，模型组除常规喂养饲料外给予0.9%生理盐水2mL，1日1次灌胃。加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量组动物在造模成功后，按低、中、高剂量分别给予加味柴芍六君颗粒溶液0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL（分别相当于成人用量的6、12、24倍灌胃给药，灌胃量按1mL/100g，每日1次）。莫沙必利组给予莫沙必利片1.5mg／kg灌胃，每日1次。每组均连续灌胃14天。

粪便颗粒数及含水量测定。每日分别收集每只大鼠灌胃后3h内及3～24h间的大便，计大便粒数，电子天平称湿质量，微波烘烤8min后称干质量，计算大便含水量百分比。含水率=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

小肠推进试验。最后一次灌胃给药后，各组大鼠禁食（不禁水）24h后，每只大鼠用灌胃针灌10%活性炭末混悬液2mL。30min后，2%戊巴比妥钠溶液以腹腔注射麻醉，随后打开腹腔，将幽门至回盲部完整取出。在不牵拉的前提下，把肠管平铺成直线，测量小肠的全长（幽门至回盲部）及炭末混悬液在小肠内推进的距离。推进率=活性炭末混悬液移动距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%，评估肠道推进功能。

免疫组化法检测5-HT的表达。结肠组织标本用10%中性甲醛固定液固定，脱水后常规蜡块包埋，制作4µm厚石蜡切片，按照SP法免疫组化试剂盒要求操作，同时以PBS代替一抗做阴性对照。光镜下拍照，应用Image-ProPlus6.0专业图像分析系统，选取阳性细胞表达的积分光密度、平均光密度等项指标对图片进行半定量分析。

用SPSS17.0统计软件进行数据分析。

3 结 果

3.1 一般状态观察

正常组大鼠皮毛光泽色白，精神佳，活泼，饮食正常，大小便正常。

模型组大鼠造模初期表现为烦躁不安，易激惹，抓咬模具，不断嘶叫。3天后活动逐渐减少，精神萎靡不振，困倦嗜卧，反应减慢，纳呆，进食量、饮水量减少，体质量增长缓慢。腹胀，皮毛枯黄无光泽，24h排便量减少，粪便干，粪便含水率降低。经加味柴芍六君颗粒治疗后，大鼠活动增加，精神好转，食量增多，体质量增加，抓取时反应灵敏，皮毛恢复光泽，大便正常。

用单因素方差分析（one-way ANOVA）对粪便颗粒数和含水率进行数据统计。各组间粪便颗粒数和含水率差异均有统计学意义（F=4.353，P=0.002；F=4.261，P=0.002）。用LSD（Least-significant Difference）法进行多组均数间的两两比较。各组大鼠粪便颗粒及含水率比较见表1。

表1 各组大鼠粪便颗粒及含水率比较 （Mean±SE）

3.2 小肠推进实验

小肠推进功能用推进率进行比较。小肠推进实验组间差异的检验用单向方差分析（one-way ANOVA），组间比较差异有统计学意义（F=29.431，P=0.000），用LSD（Least-significant Difference）法进行多组均数间的两两比较。各组大鼠小肠推进率比较见表2。

表2 各组大鼠小肠推进率比较 （Mean±SE）

3.3 免疫组化法检测结肠组织中5-HT的表达

模型组大鼠结肠组织中5-HT含量较正常组升高（P＜0.05），加味柴芍六君颗粒各组、莫沙必利组大鼠结肠组织中5-HT含量较模型组减低（P＜0.05），加味柴芍六君颗粒各组大鼠结肠组织中5-HT含量较正常组升高（P＜0.05），加味柴芍六君颗粒各组之间结肠组织中5-HT含量未见明显差异（P＞0.05）。各组大鼠结肠组织中5-HT的表达比较见表3。

表3 各组大鼠结肠组织中5-HT的表达比较

4 讨 论

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）信号通路在胃肠疾病的发生中占重要地位，它与多种胃肠道疾病包括炎症性肠病（IBD）、肠易激综合征（IBS）和肠内感染等有关。目前，5-HT受体激动剂及拮抗剂等药物治疗胃肠疾病现如今运用较广泛，但会存在药物不良反应及药物依赖性。而中医药作为一种绿色疗法对胃肠疾病具有适应症广，早期起效迅速，远期疗效稳定，多途径调节，身心共治等优点。目前及今后中医药调节胃肠疾病的机制研究备受关注。

IBS-C属于中医“便秘”“腹痛”“郁证”等范畴[5]。中医认为便秘多是由于饮食不节、情志失调、外邪犯胃、禀赋不足等原因引起，如《万病回春•大便闭》谓：“身热烦渴，大便不通者，是热闭也；久病入虚，大便不通者，是虚闭也；因汗出多大便不通者，精液枯竭而闭也；风证大便不通者，是风闭也；老人大便不通者，是血气枯燥而闭也；虚弱并产妇及失血，大便不通者，血虚而闭也；多食辛热之物，大便不通者，实热也。”其为热结、气滞、寒凝、气血阴阳亏虚引起的肠道传导失司所致。其病位在肠，同时与肺、脾、肝、胃、肾等多脏腑的功能失调有关。李桂贤教授认为其发生与“气机升降失调”密切相关。情志不舒，肝气郁结，肝脾（肝胃）失和，气机阻滞，影响升降，阻碍大肠的传导功能。由于气机不畅，气壅于大肠，使大肠之气不得疏泄，易致传导失司，糟粕蓄而不去发为便秘。而糟粕之物不得排出，会致毒邪内生，又加重了肠道失司。

5-HT是一种广泛分布的神经递质，具有调节消化道功能作用。胃肠道腺腔底部的神经内分泌细胞（EC）主要合成、分泌并再摄取外周神经系统的5-HT。5-HT几乎参与所有肠易激综合征的病理生理过程[6]。5-HT的增加，一方面导致了内脏传入神经及肠神经系统的高敏感，并激活了多种神经活性物质，使参与脑-肠调节的化学信号异常表达。另一方面5-HT作用其各种受体，引起了肠道感知、运动及分泌的改变[7-8]。由此可见，5-HT在IBS-C发生发展中具有重要意义。本实验中，加味柴芍六君颗粒能明显增加模型大鼠粪便含水量，增加小肠推进率，表明加味柴芍六君颗粒能够促进胃及十二指肠的消化活性，加强胃肠道的排空，加速小肠、大肠的蠕动，从而缩短通过时间。加味柴芍六君颗粒可抑制5-HT在结肠组织中的表达，改善肠道高敏感性及动力异常，可能为其治疗IBS-C的机制之一。