蒜素抑制人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞生长的作用及机制

翟健 韩晓晨 闫金银

[摘要] 目的 探討蒜素（Allicin）抑制人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞生长的作用及机制。方法 将培养的TPC-1细胞分为对照组和不同浓度（10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin处理组。四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）法测定不同浓度的Allicin处理24、48、72 h对TPC-1细胞生长的抑制作用。倒置显微镜和扫描电镜观察Allicin处理前后细胞形态和超微结构的变化。流式细胞术检测Allicin对细胞周期的影响。免疫细胞化学技术检测Allicin作用细胞后凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2表达的变化。 结果 与对照组比较，不同浓度的Allicin均可抑制TPC-1细胞的生长，差异有统计学意义（P < 0.05）;Allicin对细胞的抑制率与时间和浓度两大要素相关。随着Allicin浓度的增加，G2/M期细胞所占比例明显升高，G0/G1期细胞所占比例降低，除对照组与10 μg/mL Allicin组比较差异无统计学意义（P > 0.05），其他相邻浓度组两两比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，各浓度Allicin处理组细胞内的Bcl-2表达量均降低，Bax表达量均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;各相邻浓度Allicin处理组Bcl-2及Bax表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Allicin具有抑制甲状腺乳头状癌TPC-1细胞生长的作用，其机制可能与Allicin抑制细胞增殖，下调Bcl-2表达，上调Bax表达从而诱导细胞凋亡有关。

[关键词] 蒜素;甲状腺乳头状癌;细胞周期;Bcl-2;Bax

[中图分类号] R736.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（a）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Allicin inhibition on the growth of human thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells. Methods The cultured TPC-1 cells were divided into the control group and the Allicin treatment groups with different concentrations （10， 20， 30， 40， 50 μg/mL）. Methylthiazoletrazolium （MTT） method was used to determine the inhibitory effect of different concentrations of Allicin treatment on the growth of TPC-1 cells at 24， 48， 72 h. Inverted microscope and scanning electron microscope were used to observe the change of cell morphology and ultrastructure after treatment by Allicin. Flow cytometry was used to test the effects of Allicin on cell cycle. Immunocytochemical technique was used to detect the effects on expression of intracellular apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 after treatment by Allicin. Results Compared with the control group， different concentrations of Allicin could inhibit the growth of TPC-1 cells， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the inhibition rate of Allicin on cells was related to time and concentration. With the increase of Allicin concentration， the proportion of G2/M phase cells was significantly increased， while that of G0/G1 phase cells was decreased. All pairwise comparison of adjacent concentration groups showed statistically significant differences （P < 0.05） except the control group and 10 μg/mL Allicin group （P > 0.05）. Compared with the control group， the intracellular Bcl-2 expression was decreased and Bax expression was increased in every concentration of Allicin treatment group， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the expression levels of Bcl-2 and Bax in Allicin treatment groups with different adjacent concentrations were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Allicin can inhibit the growth of TPC-1 cells of papillary thyroid cancer， and its mechanism may be related to inhibition of cell proliferation by Allicin and the induction of apoptosis by down-regulating Bcl-2 and up-regulating Bax.

[Key words] Allicin; Papillary thyroid carcinoma; Cell cycle; Bcl-2; Bax

甲状腺癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国发病率逐年上升，尤其是在我国沿海地区发病率增长速度更快，女性因受到雌激素的影响，发病率也明显高于男性[1-2]。甲状腺癌类型包括未分化癌、乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌。其中乳头状癌最为常见，恶性度较低，预后较好。当前医学界对于甲状腺癌的主要治疗方式为手术切除，患者术后需要服用相关药物来完成辅助治疗，但临床治疗结果表明部分甲状腺乳头状癌在病情发生、发展过程中出现失分化，生长速率加快，进而出现癌细胞转移等特征，从而影响患者的愈后。因此，寻找新的安全、有效的辅助疗法，对提升甲状腺乳头状癌的临床治疗效果，同时保证患者的生存质量，减少患者痛苦具有重要意义。蒜素（Allicin）是葱科葱属植物大蒜的鳞茎（大蒜头）中提取的具有生物活性的有机硫化合物的总称，Allicin是一种天然抗菌、抗感染成分，可有效提高人体免疫力，防治心血管疾病及肿瘤[3-5]。本研究通过体外实验探寻Allicin抗甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的作用及可能机制，为其在临床的开发应用及最终转化为产品提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

人甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1（百恩维生物科技有限公司）;Allicin（北京世纪奥科生物技术有限公司）;兔抗人Bax/Bcl-2单克隆抗体、二抗（抗兔）以及DAB显色试剂（生工生物工程股份有限公司）;四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;FC酶标仪（美国热电公司）;BX53显微镜（日本奥林巴斯公司）;FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养  人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、37℃饱和湿度恒温培养箱中进行培养。

1.2.2 MTT法检测细胞生长抑制率  收集对数生长期TPC-1细胞以4×104个/mL的密度接种到96孔板，200 μL/孔，待细胞贴壁后换液，每孔分别加入200 μL含不同浓度（0、10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin的培养基，以含0 μg/mL Allicin的培养基作为对照组，以其他浓度作为实验组，同时设置空白组（不加细胞），针对实验组和对照组每个浓度设置5个平行孔。37℃、5%CO2饱和湿度的培育箱中分别孵育24、48、72 h后向每孔中添加浓度为5 mg/mL的MTT 20 μL，在添加完成之后继续培养4 h，隨后用吸量管吸去各孔培养基，每孔加入DMSO 150 μL，震荡溶解10 min，在酶标仪上检测吸光度值（A）（波长570 nm）并根据结果计算每组细胞生长抑制率，其计算公式为：（1-实验组A/对照组A）×100%，每组试验均重复3次。

1.2.3 细胞形态学观察  细胞常规传代培养至贴壁后换液，分别加入含不同浓度Allicin的培养基，对照组（0 μg/mL），实验组（30 μg/mL），孵箱中培养48 h后倒置显微镜观察细胞形态变化，收集细胞经2.5%戊二醛固定后OTO法处理，酒精脱水，在临界点处进行真空喷镀，随后用电镜对细胞形态和结构变化进行观察。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期  TPC-1细胞接种在培养瓶中，培养至对数期时换液，分别给予含不同浓度（0、10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin的培养基，以含0 μg/mL Allicin的培养基作为对照组，以其他浓度作为实验组，培养48 h后1000 r/min离心5 min收集细胞（离心半径13.5 cm），冷PBS洗涤，洗涤完成后进行离心处理，75%乙醇-20℃固定24 h后2000 r/min离心5 min（离心半径13.5 cm）去固定液，冷PBS重悬洗涤细胞1000 r/min离心5 min（离心半径13.5 cm）收集细胞，分别加入RNase和PI染料重悬，细胞悬液用300目滤网过滤，用流式细胞仪对处理完成的细胞进行细胞周期检测。

1.2.5 免疫细胞化学方法检测细胞蛋白表达情况  细胞爬片后分别给予含不同浓度（0、10、20、30、40、50 μg/mL）Allicin的培养基，以含0 μg/mL Allicin的培养基作为对照组，以其他浓度作为实验组，孵箱中培养48 h后应用免疫细胞化学方法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达情况，应用IPP软件分析Bcl-2和Bax的IOD值。

1.3 统计学方法

用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Allicin对TPC-1细胞生长的影响

MTT结果显示，不同浓度Allicin均可抑制人体甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖，同一时间点相邻浓度组比较以及组内相邻时间点比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）;Allicin对细胞的抑制率与时间和浓度两大要素相关。见表1。

2.2 Allicin对细胞形态的影响

对照组细胞紧密排列，贴壁生长，外形为不规则的多边形，细胞膜光滑且轮廓清晰，细胞大小均一，具有良好的透光性，细胞活性良好，未见大量死亡细胞，生长状态良好。实验组细胞皱缩、体积变小、轮廓模糊，细胞间隙大且细胞透光度有所下降，通过显微镜观察可见大量无活性细胞，细胞生长状态较差。见图1。

2.3 Allicin对细胞超微结构的影响

对照组细胞呈现多边形，细胞膜上可见大量微绒毛紧密排列，细胞内细胞器形态完好，线粒体结构清晰，内部无空泡。细胞核浆均较大，核仁形态正常，细胞内染色质均匀分布，且时而可见多个核仁，细胞形态正常。实验组细胞体积变小，胞浆有所降低，细胞表面微绒毛减少，在细胞内可见空泡，细胞核膜呈现内陷状，核质比降低，细胞染色质分布不规则，呈固缩样改变，部分细胞可见胞核的碎裂和溶解，可见细胞凋亡样改变。见图2。

2.4 Allicin对TPC-1细胞周期变化的影响

实验组细胞基因表达出现紊乱，G2/M期细胞占比随Allicin浓度提升而明显升高，G0/G1期细胞占比随Allicin浓度升高而逐渐降低，除对照组（0 μg/mL Allicin）与10 μg/mL Allicin组比较差异无统计学意义（P > 0.05），其他相邻浓度组两两比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图3、表2。

2.5 Allicin对Bcl-2和Bax在细胞中表达的影响

对照组与各实验组中均有Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达，对图片进行分析后可以发现，随着Allicin浓度增加，Bcl-2表达量降低，而Bax表达量增加。与对照组比较，各浓度Allicin处理组细胞内的Bcl-2表达量均降低，Bax表达量均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;各相邻浓度Allicin处理组Bcl-2及Bax表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表3、图4（封四）。

3 讨论

Allicin是葱科葱属植物大蒜的鳞茎（大蒜头）中提取的具有生物活性的有机硫化合物的总称，作为一种天然源特性的药物，Allicin具有抵抗细菌感染，防治心血管相关疾患，防治多种肿瘤，提高机体免疫功能等功效[3-5]。近年来有研究发现该活性物在乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、卵巢癌等多种常见恶性肿瘤临床治疗中有明显效果[6-8]。本研究通过体外实验探寻Allicin抗甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的作用及可能机制，为其在临床的开发应用及最终转化为产品提供进一步理论依据。

显微镜下观察显示，人体甲状腺乳头状癌TPC-1细胞具有多形性，胞膜光滑，细胞结构清晰，具有良好透光性，细胞膜表面微绒毛较多，各细胞器清晰可见，且时而可见多个核仁。Allicin处理组可见细胞体积变小，胞浆有所降低，细胞表面微绒毛较处理前减少，在细胞内可见空泡，细胞核膜呈现内陷状，核质比降低，细胞染色质分布不规则，呈固缩样改变，部分细胞可见胞核的碎裂和溶解，可见细胞凋亡样改变。以上结果与Zhang等[9]研究Allicin抗胃癌效果和谭祺媛[10]在Allicin抗结肠癌中观察到的结果一致。由此可见，Allicin除了能诱导胃癌、结肠癌等恶性肿瘤细胞的凋亡，同时也可有效促进TPC-1细胞出现凋亡。

实验组细胞基因表达出现紊乱，G2/M期细胞占比随Allicin浓度提升而明显升高，G0/G1期细胞占比随Allicin浓度升高而逐渐降低，除对照组与10 μg/mL Allicin组比较差异无统计学意义（P = 0.443），其他相邻浓度组两两比较差异均有统计学意义（P < 0.05）;与对照组比较，各浓度Allicin处理组细胞内的Bcl-2表达量均降低，Bax表达量均升高，各相邻浓度Allicin处理组Bcl-2及Bax表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），呈剂量依赖性。但目前，造成G2/M期阻滞的具体机制并不完全清楚，Xiao等[11]研究结论指出，造成肺癌细胞G2/M期的阻滞与Allicin抑制了细胞周期蛋白（Cyclin）的表达有关。Kelkel等[12]研究发现Allicin作用后B细胞淋巴瘤微管蛋白解聚纺锤体微管形成过程受阻，有效阻止了细胞增殖过程。此研究结果从理论上证实了Allicin可以抑制TPC-1增殖，进而达到一定抗癌效果，为未来的甲状腺乳头状癌的临床治疗以及其他恶性肿瘤治疗提供了理论依据。

免疫细胞化学结果显示，对照组与实验组中Bcl-2和Bax蛋白均有表达，但随着Allicin浓度升高，Bcl-2表达量降低，Bax表達量增加。许多研究已证实Bcl-2蛋白表达具有控制细胞凋亡的作用[13-14]，Bcl-2蛋白有两类：一类为控制凋亡作用蛋白，如Bcl-XL、Bcl-W等;另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bid等[15]。研究表明，当Bcl-2表达量小于Bax，则两者共同作用形成同源二聚体，从而降低线粒体膜电位，提高线粒体的通透能力，促进细胞色素C释放[16-18]，进而激活Caspase-9和Caspase-3，引起细胞凋亡[19-20]。本研究结果提示Allicin可通过线粒体途径促进TPC-1细胞凋亡。

综上所述，Allicin作用于TPC-1细胞可抑制其增殖，诱导细胞凋亡，从而达到治疗甲状腺癌的目的，提示Allicin可能成为甲状腺癌手术和放化疗治疗之外的一种新的辅助性治疗手段，值得进一步的实验和临床研究。

[参考文献]

[1]  Paes JE，Hua K，Nagy R，et al. The relationship between body mass index and thyroid cancer pathology features and outcomes：a clinicopathological cohort study [J]. Clin Endocrinol Metab，2010，95（9）：4244-4250.

[2]  Chu R，van Hasselt A，Vlantis AC，et al. The cross-talk between estrogen receptor and peroxisome proliferator-activated receptor gamma in thyroid cancer [J]. Cancer，2014，120（1）：142-153.

[3]  Casella S，Leonardi M，Melai B，et al. The role of diallyl sulfides and dipropyl sulfides in the in vitro antimicrobial activity of the essential oil of garlic，Allium sativum L，and leek，Allium porrum L [J]. Phytother Res，2013，27（3）：380-383.

[4]  Lai KC，Hsu SC，Kuo CL，et al. Diallyl sulfide，diallyl disulfide，and diallyl trisulfide inhibit migration and invasion in human colon cancer colo 205 cells through the inhibition of matrix metalloproteinase-2，-7，and -9 expressions [J]. Environ Toxicol，2013，28（9）：479-488.

[5]  Borkowska A，Sielicka-Dudzin A，Herman-Antosiewicz A，et al. Diallyl trisulfide-induced prostate cancer cell death is associated with Akt/PK dephosphorylation mediated by P-p66shc [J]. Nutr，2012，51（7）：817-825.

[6]  Antony ML，Singh SV. Molecular mechanisms and targets of cancer chemoprevention by garlic-derived bioactive compound diallyl trisulfide [J]. Exp Biol，2011，49（11）：805-816.

[7]  Li Y，Zhang J，Zhang L，et al. Diallyl trisulfide inhibits proliferation，invasionand angiogenesis of osteosarcoma cells by switching on suppressor microRNAs and inactivating of Notch-1 signaling [J]. Carcinogenesis，2013，34（7）：1601-1610.

[8]  Murai M，Inoue T，Suzuki-karasaki M，et al. Diallyl trisulfide sensitizes human melanoma cells to TRAIL-induced cell death by promoting endoplasmic reticulum-mediated apoptosis [J]. Oncol，2012，41（6）：2029-2037.

[9]  Zhang W，Ha M，Gong Y，et al. Allicin induces apoptosis ingastric cancer cells through activation of both extrinsic and intrinsic pathways [J]. Oncol Rep，2010，24（6）：1585-1592.

[10]  谭祺媛.大蒜素通过上调bax基因下调bcl-2基因诱导人结肠癌LS-174-T细胞凋亡[D].齐齐哈尔：齐齐哈尔大学，2012.

[11]  Xiao D，Zeng Y，Hahm ER，et al. Diallyl trisulfide selectively causes Bax- and Bak- mediated apoptosis in human lung cancer cells [J]. Environ Mol Mutagen，2009，50（3）：201-212.

[12]  Kelkel M，Cerella C，Mack F，et al. ROS-independent JNK activation and multisite phosphorylation of Bcl-2 link diallyl tetrasul fide-induced mitotic arrest to apoptosis [J]. Carcinogenesis，2012，33（11）：2162-2171.

[13]  Koing A，Wrazel L，Warrell RP Jr，et al. Comparaitve acivity of melarsoprol and arsenic trioxide in chlroinc B-cell leukemia lines [J]. Blood，1997，90（2）：562-570.

[14]  王立生，吴祖泽，贺福初.程序性细胞死亡相关基因及调节作用[J].生理科学进展，1996，27（2）：153-156

[15]  Zeng H，Kong X，Peng H，et al. Apoptosis and Bcl-2 family proteins，taken to chronic obstructive pulmonary disease [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（6）：711-727.

[16]  宋文静，陈小艳，赵秀兰，等.线粒体蛋白Bcl-2和Bax在肿瘤发生中作用的初步探讨[J].中国肿瘤临床，2009， 36（24）：1409-1411.

[17]  Park HY，Kim GY，Moon SK，et al. Fucoidan inhibits the proliferation of human urinary bladder cancer t24 cells by blocking cell cycle progression and inducing apoptosis [J]. Molecules，2014，19（5）：5981-5998.

[18]  胡鍇，刘好朋，万婷，等.线粒体与细胞凋亡的关系[J].中国畜牧兽医，2010，37（12）：86-88.

[19]  于翠娟，孟艳玲，王成济，等.凋亡诱导因子是线粒体内介导核凋亡的最主要蛋白质之一[J].生物化学与生物物理进展，2002，29（2）：177-179

[20]  Reed JC. Double identity for Proteins of Bcl-2 family [J]. Nauter，1997，387（6635）：773-776.

（收稿日期：2018-09-04  本文编辑：罗乔荔）