银杏内酯K的制备工艺研究

崔龙 胡少银 高进等

[摘要] 目的 优选银杏内酯K的制备工艺。 方法 以银杏内酯B为原料，以银杏内酯B的收率为指标，考察投料比（银杏内酯∶二乙氨基三氟化硫）、反应溶剂用量比（银杏内酯∶二氯甲烷）、反应时间、反应温度，采用正交试验设计优选银杏内酯K的最佳制备工艺条件，并采用波谱法鉴定其结构，高效液相色谱法测定其含量，色谱条件为：ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：水-甲醇-异丙醇（60∶35∶5）;柱温：30℃;流速：1.0 mL/min;检测波长：220 nm。 结果 银杏内酯K的最佳制备工艺条件为投料比1∶4.5，反应溶剂用量比1∶30，反应时间20 min，反应温度4℃;所得目标化合物经Q-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR和二维核磁共振谱鉴定为银杏内酯K。 结论 该制备工艺条件温和、制备周期短、操作简便、收率高，适合工业化生产。

[关键词] 银杏内酯;银杏内酯K;氟化试剂;结构鉴定

[中图分类号] R283          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（a）-0043-04

[Abstract] Objective To optimize the preparation process of ginkgolide K. Methods Taking ginkgolide B as raw material， the yield of ginkgolide B as index， the ratio of feed （ginkgolide ∶ diethylaminotrifluoride）， the ratio of reaction solvent （ginkgolide ∶ dichloromethane）， reaction time and reaction temperature were investigated. The optimum preparation conditions of ginkgolide K were optimized by orthogonal design， and its structure was identified by spectroscopy and the content was detected by high performance liquid chromatography. The high performance liquid chromatography was performed on a ZORBAX SB-C18 chromatography column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） and with the detection wavelength at 220 nm. The mobile phase was water-acetonitrile-isopropyl alcohol （60∶35∶5）， flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 30℃. Results The optimum preparation conditions of ginkgolide K were as follows： the feed ratio was 1∶4.5， solvent ratio was 1∶30， reaction time was 20 min and reaction temperature was 4℃. The target compound was identified as ginkgolide K by Q-TOF-MS， 1H-NMR， 13C-NMR and two-dimensional NMR spectroscopy. Conclusion The preparation process is mild， the preparation cycle is short， the operation is simple， the yield is high， and it is suitable for industrial production.

[Key words] Ginkgolide; Ginkgolide K; Fluoride reagent; Structural identification

银杏内酯K是一种强的天然血小板活化因子拮抗剂，能有效改善脑缺血再灌注造成的小鼠神经细胞的损伤，减少组织坏死，对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用[1-5]，它可以抑制H2O2、谷氨酸等诱导的细胞调亡，减轻受损细胞的氧化应激水平[6-7]，并有效改善内质网应激引起的细胞凋亡，治疗心血管疾病[8]。银杏内酯K 对血小板活化因子介导的中性粒白细胞葡萄糖酸苷酶释放的抑制作用优于银杏内酯B，对脑缺血再灌注急性期神经损伤中的保护作用优于银杏内酯B以及白果内酯[9-12]。然而，银杏叶中银杏内酯K的含量极低，且分离困难，严重制约了该化合物的应用研究。

目前，尚无银杏内酯K制备的研究报道。Bolshakov等[13]报道了银杏内酯A、10-苄基-银杏内酯C在二乙氨基三氟化硫存在的条件下，高选择性地作用于其三级醇羟基，分别生成了银杏内酯L和3，14-脱水-10-苄基-银杏内酯C。根据上述报道可知，二乙氨基三氟化硫對银杏内酯类化合物的三级醇羟基有较好的选择性，对其中的二级醇羟基也有一定的作用。本研究以银杏内酯B为原料，以投料比（银杏内酯∶二乙氨基三氟化硫）、反应溶剂用量比（银杏内酯∶二氯甲烷）、反应时间、反应温度考察因素，采用正交试验设计对银杏内酯K的制备工艺进行优选，以期为其工业化生产和应用研究提供帮助。

1 仪器与试药

1.1 仪器

MS205DU电子天平（梅特勒-托利多，0.01/0.1 mg）、Bruker AM-400核磁共振仪（瑞士Bruker公司）、Q-TOF-LC-MS联用仪、Agilent 1260型高效液相色谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]、N-1100旋转蒸发仪-循环冷却装置[埃朗科技贸易（上海）有限公司]、SH05-3G恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦有限公司）、BCD-218冰箱（西门子）、LGJ-12型冷冻干燥机（北京松源华兴有限公司）。

1.2 试药

银杏内酯B（批号：160501，纯度：91.2%，购自临沂爱康药业有限公司）、银杏内酯K（批号：111936-201502，纯度：94.7%，购自中国食品药品检定研究院）。

二乙胺基三氟化硫[购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]，甲醇、异丙醇、二甲基亚砜为色谱纯，二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 银杏内酯K制备

取0.43 g银杏内酯B（0.1 mol），加入装有30 mL二氯甲烷的三口反应瓶中，置于冰水浴上搅拌溶解，同时缓慢加入60 μL（0.45 mol）二乙氨基三氟化硫，冰水浴中4℃保温反应20 min后，加入冰水淬灭反应，充分搅拌反应液，分离水相。用乙酸乙酯萃取水相，乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水，减压浓缩蒸出溶剂即得银杏内酯K粗品。银杏内酯K粗品用乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂结晶48 h（结晶48 h后结晶物不再增加），得到白色结晶片状固体，减压干燥12 h，即得目标产物，称重，计算收率。化学反应式见图1。

2.2 银杏内酯K含量测定

2.2.1 对照品溶液制备  取银杏内酯K对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.05 mg/mL的对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备  称取银杏内酯K样品约5 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.2.3 色谱条件与系统适用性试验  采用HPLC法测定银杏内酯K的含量，参考相关研究[14-16]的方法并进行了优化。色谱条件为：ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：水-甲醇-异丙醇（60∶35∶5）;柱温：30℃;流速：1.0 mL/min;检测波长：220 nm。理论塔板数以银杏内酯K计不低于10 000。

2.2.4 银杏内酯K测定方法  照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版通则0512）测定。精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法计算银杏内酯K的含量，即得。

2.3 正交实验设计

在单因素试验的基础上，取银杏内酯B原料9份，每份0.43 g，以银杏内酯K的收率为评价指标，考察投料比（银杏内酯∶二乙氨基三氟化硫）、反应溶剂用量比（银杏内酯∶二氯甲烷）、反应时间和反应温度，采用四因素三水平的L9（34）正交表优选银杏内酯K的制备工艺。因素水平见表1，正交表及试验结果见表2。

四个因素对银杏内酯K的收率影响大小为：投料比>反应时间>溶剂用量比>反应温度。最佳的工艺条件为投料比为1∶4.5，反应溶剂用量比为1∶30，反應时间为20 min，反应温度为4℃。见表2。方差分析表明，各因素试验水平对银杏内酯K的收率均无显著性影响。见表3。

2.4 验证试验

取银杏内酯B原料3份，每份约10 g，根据正交试验设计优选的最佳制备工艺条件进行3批验证试验。3批验证试验表明，银杏内酯K的收率分别为75.10%、75.74%、75.29%，均值为75.38%，RSD为0.44%，表明该工艺稳定性良好。

2.5 结构确证

通过化学合成的方法制备、分离纯化得到的化合物为白色片状结晶（乙醇-乙酸乙酯），进一步用质谱及核磁共振谱分析其结构。TOF-MS-ES-（m/z）405.1167（计算值为405.1186）。见图2。1H-NMR、13C-NMR数据（表4～5）与Weinges等[17]的研究报道一致。结合上述质谱、1H-NMR、13C-NMR以及二维核磁谱H-H COSY、HSQC、HMBC和NOESY的数据，确定该化合物为银杏内酯K，分子式为C20H22O9。其结构见图3。

3 讨论

近年来，银杏内酯K在脑血管疾病中的作用机制研究取得了新的进展，其作用机制可能与银杏内酯A、B等化合物不同[18]，但还需要进一步研究。与银杏内酯K制备有关的文献报道较少。在某些条件下，银杏内酯B的3-OH被活化，产生其衍生物银杏内酯K，但其转化率非常有限[19]。Zekri等[20]研究表明，银杏内酯环结构的稳定性与其溶解介质的pH值密切相关，当pH=7时，其内酯环开始开环，在碱性条件下不稳定易开环，易造成副产物的增多。因此，在碱性条件下制备银杏内酯K的方法产率低且副产物较多，不适合工业化生产。

本研究选用最常见的氟化试剂二乙氨基三氟化硫，其对银杏内酯类化合物的三级醇羟基有较好的选择性，且适当过量的二乙氨基三氟化硫更有利于反应。另外，这可能对其二级醇羟基也有一定的作用，但未分离到氟代的产物，与Bolshakov等[13]的研究报道基本一致。本研究采用正交试验设计得到银杏内酯K的最佳制备工艺条件，即投料比为1∶4.5，溶剂用量比为1∶30，反应时间20 min和反应温度4℃。在此工艺条件下，制备、纯化银杏内酯K的收率大于75%。该制备工艺操作简单、周期短、稳定性好，适合工业化生产。

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（收稿日期：2018-02-28  本文编辑：王   蕾）