上调miRNA-27a-3p对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

蒋雪梅，权 毅

西南医科大学附属医院乳腺外科 四川泸州 646000

乳腺癌是发生于乳腺腺上皮组织的一种恶性肿瘤，癌细胞极易脱落游离，导致远端转移[1]，而肺、骨、脑等全身重要器官的转移均能直接威胁患者的生命，给乳腺癌的临床治疗增加了极大的困难[2]。近期研究[3-4]显示，miRNA(miR)-27作为一种癌基因，在多种肿瘤中发挥致癌作用。miR-27在胃癌组织和细胞中呈高表达，能够通过抑制ZBTB10蛋白的表达促进胃癌细胞的侵袭和转移[5]。上调miR-27表达能够促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭[6]。抑制miR-27的表达能够通过调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭[7]。目前研究[8]发现miR-27在乳腺癌组织中异常表达，且在浸润性乳腺癌中表达显著上调，提示miR-27可能是乳腺癌进展的重要标志物。因此本实验通过在人乳腺癌MCF-7细胞中转染miR-27 模拟物，探究上调miR-27对乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移等恶性生物学行为的影响及其作用的分子机制，以期为乳腺癌的治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂MCF-7细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；miR-27a-3p 模拟物及模拟物对照购自广州锐博生物科技有限公司；实验所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；Trizol提取试剂盒购自日本TaKaRa公司；反转录试剂盒、SYBR Green qRT-PCR Master Mix购自大连宝生物工程有限公司；CCK-8试剂购自上海翊圣生物科技有限公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司；ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；PCNA、MMP-2、MMP-9抗体及二抗购自美国CST公司。

1.2细胞分组MCF-7细胞培养在含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，置于体积分数5% CO2、95%湿度、37 ℃细胞培养箱中培养，根据细胞生长状态更换新的培养基。待细胞生长至约70%融合时，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞，进行传代。取第3代细胞用于后续实验。取对数生长期的细胞接种于6孔板中，置于37 ℃培养箱中继续培养，待细胞生长至50%融合时按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别转染miR-27a-3p 模拟物和模拟物对照，分别记为模拟物组和阴性对照组。未进行转染处理的细胞记为空白对照组。3组MCF-7细胞置于37 ℃培养箱中继续培养。

1.3qRT-PCR法检测3组细胞中miR-27a-3p的水平收集转染48 h后的MCF-7细胞，以Trizol试剂盒提取细胞总RNA，检测其浓度和纯度后，采用反转录试剂盒合成cDNA，操作步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行。获取的cDNA调整浓度后采用SYBR Green qRT-PCR Master Mix进行PCR反应。miR-27a-3p上游引物5’-CACGCAATCTCTCT GGCG-3’，miR-27a-3p下游引物5’-CCAGTG CAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物5’-CTCGT TCGGCAGCACA-3’，U6下游引物5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；最后72 ℃终延伸10 min。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算细胞中miR-27a-3p的相对表达量。实验重复3次。

1.4CCK-8实验检测3组细胞增殖能力将3组细胞接种于96孔板中，接种密度为1×105个/孔，培养24、48、72、96 h后分别在每孔中加入100 μL的CCK-8试剂，置于37 ℃培养箱中避光孵育30 min。以酶标仪于450 nm波长处检测细胞的吸光度值(A值)，以A值表示细胞增殖能力。实验重复3次。

1.5Transwell实验检测3组细胞迁移和侵袭能力常规消化细胞，离心并收集，以无血清的DMEM培养基重悬细胞，制成密度为2.5×104个/mL的细胞悬液。取200 μL细胞悬液接种于Transwell小室的上室，在下室中加入800 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃培养箱中培养48 h。取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未穿透的细胞，以PBS洗涤3次，置于室温下晾干约10 min，加入100 μL的吉姆萨染液进行染色，于室温下静置20 min，然后以PBS洗涤3次，显微镜下观察，每组选取10个视野(×100)，计数穿膜细胞数，以表示细胞迁移能力。实验重复3次。

将Matrigel基质胶于4 ℃冰箱中融化，然后于冰上将Matrigel胶与DMEM培养基以1∶4体积比混合，以20 μL/孔铺于Transwell小室的上室，置于37 ℃培养箱中晾干，使用前30 min以无血清培养基清洗上室，吸取培养基后加入200 μL细胞悬液，下室加入800 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃培养48 h。以PBS洗涤3次，除去PBS及悬浮的细胞，晾干，以甲醇固定10 min，结晶紫染色5 min，去离子水冲洗，晾干，倒置显微镜(×100)下计数细胞，以表示细胞侵袭能力。实验重复3次。

1.6Westernblot检测3组细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白的表达细胞转染48 h后，除去培养基，以 PBS洗涤3次，加入预冷的裂解液置于冰上充分裂解，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，去上清，以BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白与上样缓冲液按1∶4体积比混匀，在沸水中加热10 min，使蛋白变性，以每孔30 μg变性蛋白样品进行凝胶电泳(100 g/L分离胶、50 g/L浓缩胶)，电泳条件：110 V恒压电泳2 h。电泳结束后，4 ℃下250 mA恒流转膜2 h。转膜结束后，在50 g/L的牛血清蛋白中于室温下孵育2 h。PCNA(按1∶1 000稀释)、MMP-2(按1∶800稀释)、MMP-9(按1∶800稀释)一抗杂交，4 ℃过夜孵育。二抗(按1∶2 000稀释)杂交，室温孵育2 h。ECL显色，化学发光成像仪曝光，以GAPDH为内参，以目的蛋白与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析。3组间miR-27a-3p相对表达量，A值，侵袭细胞数，迁移细胞数，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组细胞中miR-27a-3p的表达水平qRT-PCR检测结果显示，空白对照组、阴性对照组、模拟物组MCF-7细胞中miR-27a-3p相对表达量分别为(1.00±0.01)、(1.01±0.01)、(2.76±0.31)(F=95.953，P<0.001)。与两个对照组比较，模拟物组miR-27a-3p相对表达量升高(P<0.05)。

2.2 3组细胞增殖能力的比较结果见表1。与其他2组比较， 模拟物组MCF-7细胞在24、48、72、96 h时增殖能力均增强。

表1 各组MCF-7细胞A值的比较(n=3)

*：与其他2组比较，P<0.05

2.3 3组细胞侵袭和迁移能力的比较结果见表2。与其他2组比较，模拟物组侵袭和迁移细胞数均增多。

表2 各组MCF-7细胞侵袭和迁移细胞数的比较(n=3)

*：与其他2组比较，P<0.05

2.4 3组细胞中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的比较结果见图1和表3。与其他2组比较，模拟物组MCF-7细胞PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均升高。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：模拟物组

组别PCNAMMP-2MMP-9空白对照组0.14±0.020.57±0.040.61±0.05阴性对照组0.13±0.020.54±0.050.59±0.06模拟物组0.75±0.08∗1.43±0.08∗1.48±0.11∗F157.625218.943127.698P<0.001<0.001<0.001

*：与其他2组比较，P<0.05

3 讨论

乳腺癌细胞的增殖及转移给临床治疗造成很大的困难，因此有效抑制乳腺癌细胞的恶性生物学行为成为治疗乳腺癌的重要措施[9]。miR是一类广泛存在的非编码的小片段核糖核酸分子，具有调控生命活动的功能。目前研究[10-12]显示，miR在乳腺癌的发生和发展中具有至关重要的作用。研究[13]发现，miR-27在肾癌中通过调控FOXO1的表达发挥致癌作用。胃癌患者外周血中miR-27含量异常升高，且miR-27能够促进胃癌细胞的转移和侵袭[14]。miR-27a可影响甲状腺癌细胞的迁移、侵袭，提示miR-27a可能作为甲状腺癌的生物标志物[15]。本研究中发现，转染miR-27a-3p模拟物能够成功上调MCF-7细胞中miR-27a-3p的表达。上调miR-27a-3p表达后，MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭能力均提高。

miR-27具有调控多种靶基因和信号通路的作用。Wang等[16]的实验表明，miR-27通过调控Wnt信号通路抑制人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化。利拉鲁肽能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖，且能促进MCF-7细胞凋亡，其机制可能与利拉鲁肽下调miR-27a表达有关[17]。本实验中模拟物组MCF-7细胞中PCNA表达水平显著升高，说明在乳腺癌MCF-7细胞中miR-27a-3p通过上调PCNA的表达促进细胞增殖。MMP-2和MMP-9属于MMP家族，其主要功能是维持重塑和降解细胞外基质的动态平衡，参与肿瘤细胞迁移和侵袭过程[18-20]。本实验结果显示模拟物组MCF-7细胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平明显升高，提示miR-27a-3p通过上调MMP-2和MMP-9的表达促进乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和迁移。

综上，上调miR-27a-3p能够促进乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移，其作用机制与促进PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达有关。