多发性骨髓瘤中异常表达的长链非编码RNA的作用机制及临床应用研究进展

沈敏，黄梅

(华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉 430030)

多发性骨髓瘤(MM)是骨髓浆细胞的异常克隆增殖性疾病，约占血液恶性肿瘤的10%，为血液系统第二常见的肿瘤[1]。近年来新型诊疗技术虽很大程度改善了患者生存预后，但MM仍不可治愈，疾病复发仍是该病的普遍特征。随着全基因组测序技术的发展，人们对MM的诊治模式逐渐向精准医疗模式转变。长链非编码RNA(lncRNA)指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不具有编码蛋白质的开放阅读框，但可与DNA、RNA和蛋白质相互作用。通过染色质重塑、可变剪接、调控细胞周期及生长分化、组蛋白修饰、转录干扰、基因印记等方式，在表观遗传学、转录水平、转录后水平参与基因调控或形成调控的表达网络，产生致癌或抑癌生物学功能，最终对肿瘤的发生发展、侵袭转移、诊断预后及治疗产生不同程度影响。本文重点针对目前国内外对于lncRNA在MM中的研究成果进行综述，分析对功能性lncRNA调控的分子机制，探讨其在MM诊断、预后及治疗的临床应用价值。

1 lncRNA的分类及生物学功能

随着基因组测序技术的发展，人们发现非编码基因占全人类基因组98%以上。lncRNA在哺乳动物转录组非编码RNA中占很大比例。曾因其表达量低、保守性差及滞留胞核内等特点，lncRNA功能一直被忽视，长期以来被认为是“垃圾序列”或“转录噪音”。而近年来研究表明，lncRNA在细胞调控网络中发挥巨大作用。lncRNA根据染色体上编码基因的位置、调控类型和作用模式，大概可分为：基因间型、内含子型、正义型、反义型、反向型、启动子上游型、启动子型、转录起始位点型[2]。lncRNA的调控机制十分复杂，目前对lncRNA的生物学功能研究主要集中于：染色体重塑，激活/抑制基因；转录的调控；表观遗传学调控；调节mRNA可变剪接；稳定mRNA的结构；调节翻译过程；miRNA分子海绵；改变蛋白质定位及活性；翻译产生短肽(图1)[3,4]。

图1 lncRNAs调控机制模式图

2 MM中异常表达lncRNA及其调控机制

2.1 高表达的lncRNA及其促癌机制

2.1.1 MALATl MALATl是研究最多的lncRNA之一,定位于人染色体11q13，在多种实体瘤中证实呈高表达。Li等[5]研究MM骨髓间充质干细胞(MSCs)的MALAT1的生物学功能发现，MALATl通过提高MSCs中转录因子Sp1的活性，并形成MALATl-Sp1复合体，随后招募促进Sp1至LTBP3基因的启动子区域，增强其表达并调控下游的TGF-β而发挥作用。Liu等[6]体内外实验发现，沉默MALAT1后可使MM细胞周期阻滞于G1期，并通过激活Caspase-3/-9、上调Bax、下调Bcl-2表达促进MM细胞凋亡。Amodio等[7]设计靶向抑制MALAT1的探针(g#5)，发现MALAT1依赖的蛋白酶体调控机制是通过NRF1-2/KEAP通路实现的。特异性拮抗MALAT1表达后可通过负性调控因子KEAP1，降低蛋白酶体转录活化因子NRF1和NRF2的活性，最终导致胰蛋白酶、糜蛋白酶和Caspase样蛋白酶体活性降低，多聚泛素化蛋白富集；反过来NRF1又可促进MALAT1表达，并形成了正反馈环而发挥调控MM作用。Gu等[8]采用qRT-PCR从细胞、动物及临床样本三个层面检测MALAT1表达水平，表明其主要机制是调控MALAT1/miR-509-5p/FOXP1轴实现，即MALAT1作为miR-509-5p的竞争性内源性RNA(ceRNA)，吸附miR-509-5p分子后直接作用于FOXP1的3′-UTR端，并对其表达产生正性调控作用。Gao等[9]对MALAT1生物学功能研究发现，MALAT1可以上调MM细胞中HMGB1的表达，促进自噬减少肿瘤细胞凋亡而发挥促癌效应。Handa等[10]认为化疗药物硼替佐米、多柔比星可上调MALAT1在MM细胞系中表达，且与髓外多发性骨髓瘤(EMM)发生及预后密切相关。Hu等[11]体内外实验研究表明，MALAT1结合于PARP1/LIG3蛋白复合体而发挥对肿瘤细胞DNA保护和抗凋亡作用。Gao等[12]发现miR-125b与MALAT1存在互补结合区，MALAT-1通过Notch1信号通路而调控MM细胞增殖，沉默细胞系NCI-H929和PRMI8226中MALAT1的表达，Notch1、HES1、Bcl-2表达均降低，而促凋蛋白c-caspase3明显增加。上述机制研究均证明了MM中高表达的MALATl是参与促癌调控的分子。

2.1.2 NEAT1 NEAT1位于人类第11号染色体上，具有两个单体形式，即NEAT1-1(3.7 kb)和NEAT1-2(23 kb)。Wu等[13]发现NEAT1在地塞米松(DEX)耐药的MM细胞株中高表达，NEAT1作为分子海绵黏附miR-193a并使其表达下调，最终导致抗凋亡蛋白MCL1增加。下调NEAT1后，可显著增强耐药株对DEX的敏感性。Geng等[14]证明MM细胞中过表达的NEAT1可诱导增殖、迁移、侵袭，而中药白藜芦醇可通过下调NEAT1而遏制此效应，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路而发挥抗MM作用。

2.1.3 H19 H19是第一个被发现的lncRNA，于1991年被Bartolomei等报道[15]。H19位于人染色体11p15.5，是印记DLK1-MEG3基因上的一个印记基因。Sun等[16]验证了H19在MM中呈高表达，沉默H19后发现可抑制MM细胞生长，并在阻滞NF-κB信号通路的同时抑制细胞因子(IL-6、IL-8)的释放，由此表明H19与NF-κB信号通路共同作用调控MM细胞生长。

2.1.4 PDIA3P PDIA3P定位于人染色体1q21.1，长度为2 099 bp，已证实在口腔鳞状细胞癌中通过负性调控miR-185-5p，并激活Cyclin D2表达促进肿瘤细胞的增殖[17]。Yang等[18]通过qRT-PCR检测发现，PDIA3P在MM细胞株及患者中明显高表达，与转录因子c-Myc相互作用，增强其表达活性后结合于G6PD启动子区域，刺激其表达并影响磷酸戊糖途径代谢，最终促进细胞增殖及耐药。

2.1.5 CRNDE CRNDE最初是在直肠癌中被鉴定出来，位于人染色体16q12.2，在许多癌组织中均表现为异常高表达。Meng等[19]通过检测MM临床样本及细胞系，发现高表达的CRNDE具有促进MM发生发展的作用，同时与预后不良显著相关。进一步机制研究表明，CRNDE作为ceRNA和分子海绵，负性拮抗miR-451分子，从而促进MM细胞增殖和发挥抗MM凋亡作用。

2.1.6 UCA1 UCA1位于人染色体19p13.12，包括3个外显子，并编码2个转录本。已证实在膀胱癌、胃癌、乳腺癌及直肠癌等恶性肿瘤中呈高表达而产生促癌作用。Zhang等[20]采用qRT-PCR检测技术发现在MM患者临床样本和细胞株UCA1呈高表达，其促增殖和抗凋亡的作用主要是通过调控细胞内的TGF-β活性来实现的。

2.1.7 CCAT1 CCAT1定位于人类染色体组8q24.21，长度为2 628 bt，与基因突变热点区转录因子c-Myc相邻，已证实具有促进肿瘤的增殖和侵袭作用。Chen等[21]发现下调CCAT1表达具有抑制MM细胞增殖、阻滞细胞周期及促进凋亡作用。在过表达实验中，高表达的CCAT1作为miR-181a-5p的分子海绵降低其表达，并对下游的HOXA1发挥正性调控作用，从而促进MM疾病的发生发展。

2.1.8 FEZF1-AS1 FEZF1-AS1是FEZF1基因的反义链，定位于人类7号染色体，可编码产生一个长2 564 nt的转录本，目前已证实与肿瘤细胞的增殖迁移能力相关。Li等[22]通过qRT-PCR、RNA免疫共沉淀、荧光素酶报告实验发现，lncRNA FEZF1-AS1作为miR-610的ceRNA，吸附并降低MM细胞内miR-610表达水平，最终对其下游Akt3产生正性调控作用而发挥抗MM效应。

2.1.9 其他 除了上述异常高表达的lncRNA可促进MM的发生发展，人们还发现linc00515可以通过促进自噬，增强MM对马法兰的耐药产生促癌效应。其主要作用机制是直接抑制miR-140-5p后，上调ATG14表达水平而促进MM发生[23]。最近，Li等[24]证实了MM细胞的外泌体可以包裹RUNX2-AS而形成外泌体lncRNA,并传送到MSCs内发挥作用。RUNX2-AS1可与RUNX2的前体mRNA在重叠区域形成双链RNA，这种双链结构降低了剪接效率从而抑制RUNX2的表达，最终导致MSCs的成骨分化活性降低。

2.2 低表达的lncRNAs及其抑癌机制

2.2.1 MEG3 MEG3是2000年Miyoshi等[25]首次鉴定出来的印记基因，其长度长约1.6 kb，位于人染色体14q32。Zhuang等[26]从分子层面上阐明了MEG3促进MSCs细胞成骨分化的机制，认为MEG3敲低可下调成骨标志物RUNX2、Osterix及骨钙素的表达，并抑制骨形态发生蛋白4(BMP4)的转录。其机理是下调的MEG3使转录因子SOX2与BMP4的启动子分离。MEG3、SOX2及BMP4的SOX2共识位点可组成稳定复合物，其中MEG3通过直接影响SOX2而激活BMP4转录。通过染色质免疫沉淀、RNA免疫共沉淀、荧光素酶报告等证实，MEG3对启动子的特异性转录激活也起到促进成骨分化的作用。Shen等[27]体内外实验研究了MEG3/miR-181a/HOXA11调控网络，发现MEG3作为miR-181a的ceRNA发挥调控作用，下调MEG3可增加miR-181a水平，而miR-181a作为促癌分子，直接作用于抑癌基因HOXA11，抑制其表达而促进MM发展。

2.2.2 PRAL PRAL位于人染色体17p13.1，在肝细胞癌、肺癌等肿瘤中作为抑癌基因。Xiao等[28]通过检测MM细胞增殖、ki67及凋亡蛋白Caspase-3的表达水平，发现PRAL可抑制MM细胞生长、促进凋亡、增强MM对硼替佐米的敏感性。其作用机制是竞争性吸附miR-210分子后上调骨形态发生蛋白2(BMP2)转录活性，而BMP2可提高硼替佐米抗MM效应。

2.2.3 OIP5-AS1 OIP5-AS1最初是从斑马鱼中鉴定出来的。OIP5-AS1位于人染色体15q15.1，调节肿瘤细胞的增殖生长。Yang等[29]体内外生物学功能实验表明，敲低OIP5-AS1可增加MM细胞内促癌分子miR-410表达，并直接结合其下游作用靶点KLF10，使PTEN/PI3K/AKT信号通路激活而促进MM进展。由此可见，OIP5-AS1在MM中发挥抑癌调控作用。

3 lncRNA在MM中的临床应用

3.1 诊断 lncRNA作为新的肿瘤预测标志物，其表达失调可为MM诊断提供重要的检测依据。Sedlarikova等[30]采用PCR基因芯片分析了84例MM和25例健康志愿者的骨髓浆细胞(BMPCs)中lncRNA表达谱，并选取异常表达的UCAl和NEATl进行验证，通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线，发现NEATl的灵敏度为55.0%，特异度为79.0%，ROC的曲线下面积(AUC)为0.773；UCAl灵敏度为85%，特异度为94.7%，AUC为0.879。Zhuang等[26]研究发现，MM患者的MSCs在成骨分化的过程中，MEG3表达水平较健康对照明显下降，提示MEG3具有作为新型生物标志物的潜力。此外，外周血中lncRNA检测作为一种非侵入手段，同样也具有十分重要的临床应用价值。如：Pan等[31]采用RT-PCR技术检测发现MM血清中H19稳定高表达。Shen等[32]通过研究60例MM患者临床参数与血清PCAT-1水平相关性，发现PCAT-1的水平虽与性别、年龄、ISS分期、LDH水平、κ轻链和λ轻链浓度等参数无明显的相关性，但是与患者β2微球蛋白浓度及MM分型密切相关。发现血清PCAT-1水平对MM诊断具有较高的灵敏度(71.7%)和特异度(93.8%)。由此可见，异常表达lncRNA作为新型诊断标志物不仅可表达于MM患者BMPCs和MSCs中，也可存在于患者外周血中，有望成为MM早期无创性诊断检测及评价的可靠指标。

3.2 预后 越来越多的研究证据表明，lncRNA在临床分期、危险分层和生存分析方面等存在重要的应用价值。Cho等[33]采用RT-PCR技术分析45例初诊、61例治疗后、18例复发或进展、20例健康对照的骨髓单个核细胞，结果显示初诊患者MALATl表达水平较健康对照明显升高，且升高程度与疾病状态具有显著相关性；经治疗后MALATl下降明显组无进展生存(PFS)期较下降不明显组明显延长(分别为24个月和11个月)。Sedlarikova等[30]发现UCA1的水平与白蛋白、血红蛋白、单克隆免疫球蛋白、细胞遗传学、生物化学和分期(ISS和DS分期)以及MM患者生存率均密切相关。Kaplan-Meier曲线结果显示，UCA1高表达组1年内病死率(37.6%)明显高于低表达组(12.1%)。Ronchetti等[34]采用基因芯片技术研究了9例健康供者和259例恶性浆细胞疾病(包括20例意义不明单克隆丙种球蛋白血症、33例冒烟型骨髓瘤、170例多发性骨髓瘤、36例浆细胞白血病)，发现了31个异常表达的lncRNA。其中lnc-LRRC47-1的表达在健康对照组中呈现明显下降趋势。lnc-SENP5-4、lnc-CPSF2-2和lnc-LRRC47-1的水平在MM初诊与相应复发/浆细胞白血病阶段具有显著性差异。Xiao等[28]发现PRAL在MM细胞系和初诊患者中明显低表达，且低表达程度与ISS分期和DS分期显著相关，生存分析发现PRAL低表达组的DSF和OS明显低于高表达组。以上研究均表明，异常表达的lncRNA与MM临床分期、危险分层及生存预后具有明显的相关性，可成为MM预后预测的重要辅助手段，为判断患者临床预后提供新的思路。

3.3 治疗 失调的lncRNA通常作为癌基因和抑癌基因发挥重要作用。lncRNA的组织特异性及在肿瘤中异常表达，为其作为MM治疗的靶点提供了可能。Amodio等[7]在细胞实验和活体动物实验中发现，沉默MM中高表达的MALATl可明显抑制细胞增殖能力及蛋白酶体活性，从而发挥治疗的作用。NEAT1在MM细胞中高表达产生致癌作用，中药白黎芦醇通过抑制NEAT1过表达而抑制细胞的增殖、迁移及侵袭[14]。此外，恢复抑癌lncRNA表达也可以实现抗癌作用。将转染PRAL表达载体后的MM细胞植入裸鼠模型，发现PRAL可以抑制细胞生长、促进细胞凋亡及增强MM对硼替佐米敏感性[28]。虽然大量实验数据均表明，针对以lncRNA为导向的治疗方案具有很大的潜力，但目前结果仅局限于MM细胞系及体外动物实验的初步研究，且在治疗靶点上鉴定仍是一个空白领域，故以lncRNA为治疗策略的研究仍需要进一步发展。

近年来，随着荧光原位RNA测序、高通量测序、交联免疫沉淀、RNA反义纯化等技术的发展，越来越多的研究表明，MM中表达失调的lncRNA与其发生发展、分化转移、诊断治疗及预后紧密相关。这些lncRNA参与不同的生物进程，可在组织或体液中呈稳定地特异性表达，使得lncRNA有望成为微创筛查诊断和预后评估的敏感分子标记物。但与MM相关lncRNA的研究还处于起步阶段，绝大多数仅局限于体外细胞实验及动物模型研究，作用机制也尚不明确。因此，寻找合适的生物学标志物，探索lncRNA对MM的调控机制，完善和改进MM的诊断和筛查方法仍具有重大临床意义。