德州驴乳清蛋白差异蛋白质组学研究

张新浩，李海静，刘景辉，杨 莉，嵇传良，赵付伟

（国家胶类中药工程技术研究中心，东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城 252200）

驴奶的营养成分比例与母乳相近，对患牛奶蛋白过敏或食物不耐受的婴儿致敏性较低［1］。另外，驴奶可促进免疫反应，预防代谢疾病［2］，适合作为老年人的营养乳品。由于驴受孕率低、产奶量少，驴奶的市场需求长期得不到解决。驴产奶量受热应激、挤奶工艺、年龄和泌乳阶段等因素影响［3］。目前对于驴奶生产的环境、管理和工艺都有较好的研究基础，但对影响驴产奶量的分子机制尚未见报道。

乳汁分泌受乳腺细胞内蛋白质表达调控［4］。随着蛋白质组学技术的发展，乳蛋白中不同成分，尤其是低丰度蛋白，也可以被准确地分析。除基于同位素标记的蛋白质组学方法外，无标签质谱分析法（MS）是一种快速、可复制、精确的定量策略，可鉴定显著差异或无显著差异的两组蛋白质样本间的全部表达蛋白［5］，已被广泛用于不同奶样蛋白质表达谱分析和鉴定潜在的生物标记蛋白［6］。本试验中，通过无标签质谱方法，首次研究了德州驴奶蛋白质组学和影响驴产奶量的分子机制，为今后开展相关研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 样本收集与处理

根据产奶记录，从山东聊城某驴场选择8头经产德州驴，年龄均5岁且处于泌乳后期。8头母驴饲喂条件相同，其中4头为高产母驴（H组），平均单次头均产奶量 1.04 kg±0.15 kg，4头为低产母驴（L组），平均单次头均产奶量0.24 kg±0.06 kg。新鲜奶样由专人手工采集，于-80℃保存。

样品解冻、混池后，5 000 r/min离心10 min，去除乳脂层。每个样品中加入哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物，去除酪蛋白［7］。加入 60 mM CaCl2，调节 pH 值至 4.3，4℃12 000 r/min离心60 min，收集上清。

1.2 蛋白提取和消化

SDT（4%SDS，100 mM Tris-HCl，1 mM DTT，pH 值7.6）缓冲液用于样品溶解和蛋白提取。采用BCA蛋白分析试剂盒（Bio-Rad，USA）进行蛋白定量，用胰蛋白酶进行蛋白消化［8］。消化后多肽经C18吸附柱（EmporeTMSPE C18 Cartridges，7 mm bed I.D.，3 mL volume，Sigma）脱盐，真空离心浓缩，复溶于40 μL浓度为 0.1%（v/v）甲酸。

1.3 LC-ESI-MS/MS分析

每个样品采用HPLC液相系统Easy nLC进行分离。缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱以95%的A液平衡，上样柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100 μm×2 cm，NanoViper C18），经过分析柱（Thermo scientific EASY column，10 cm，ID 75 μm，3 μm，C18-A2）分离，流速为300 nL/min。样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。

1.4 差异表达蛋白质（DEPs）的功能性分析

质谱数据分析使用MaxQuant和UniProtKB Equus数据库。首先，利用NCBI BLAST将目标蛋白质集合与适当的蛋白质序列数据库进行比对。其次，利用Blast2GO Command Line对目标蛋白质集合及符合条件的比对序列所关联的GO条目进行提取。可以通过InterProScan［5］搜索EBI数据库中与目标蛋白质匹配的保守基序（Motif），并将Motif相关的功能信息注释给目标蛋白质序列；并运行ANNEX对注释信息进一步补充，并在不同的GO类别之间建立联系，以提高注释的准确性。利用KAAS软件，将目标蛋白质序列进行KO归类，并获取目标蛋白质序列参与的通路信息。

通过 Fisher精确检验（Fisher's exact test），比较各个GO分类或KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况，以评价某个GO term或KEGG通路蛋白质富集度的显著性水平。使用STRING从IntAct分子相互作用数据库中检索目标蛋白质之间的相互作用关系。

2 结果与分析

2.1 产奶量数据分析

测定并记录每头母驴6个月泌乳期内的产奶量变化，从分娩后45 d开始，每15天作为1个泌乳阶段，每个阶段保证3次产奶量有效数据，H组和L组的泌乳曲线如图1所示，高产驴产奶量显著高于低产驴（P＜0.05）。

图1 高产驴与低产驴的泌乳曲线

2.2 驴乳清蛋白的定量分析

经过比对马属动物蛋白组数据库，发现了216种乳清蛋白。以倍数变化大于2.0倍（上调大于2倍或下调小于0.5），且P＜0.05的标准筛选差异表达蛋白质。结果发现，19个差异表达蛋白，高产组 HSP90AB1、HSPA8、HSP90AA1、CSE1L 等 16个蛋白上调，TUBA1A、SERPINF2、钠/核苷协同转运蛋白3个蛋白下调。H组和L组差异表达蛋白如表1所示。

2.3 DEPs分析

GO富集分析的3个功能集，细胞组分、分子功能和参与的生物过程均采用Fisher精确检验，显著性水平P＜0.05。在分子功能方面，相对比L组蛋白质，H组蛋白质与结合、催化活性、分子功能调节、结构分子活性和转运蛋白活性有关，详见表2。在生物过程的范畴中，具有不同丰度的蛋白质主要涉及细胞过程、代谢过程和生物过程调节。

在Fisher精确检验的基础上应用KEGG途径富集分析，将整个定量蛋白质作为背景数据集。差异显著性水平为P＜0.05。H组差异表达蛋白主要参与内质网蛋白合成、雌激素信号通路、Th17细胞分化、孕酮介导卵 母细胞成熟和PI3K-Akt信号通路，详见表3。

表1 H组和L组差异表达蛋白统计

表2 差异蛋白质GO富集分析

表3 差异蛋白质的KEGG通路富集分析

3 讨论

在奶牛及绵羊的产奶量差异方面，已有通过组学方法比较基因或蛋白质表达谱的研究，并鉴定候选分子生物标志物［9-10］。然而，关于德州驴产奶量的研究很少，本研究首次利用蛋白质组学方法研究了德州驴乳清蛋白变异，并分析了几个影响德州驴产奶量蛋白质的生物学作用。

在本研究 中 ，HSPA8、HSP90AA1（HSP90α）和HSP90AB1（HSP90β）在高产驴奶中显著上调。HSPA8作为ATP依赖性分子伴侣发挥作用，参与蛋白质折叠、细胞蛋白质降解和蛋白质输入［11］，且HSPA8在包含p38 MAPK的基于乳蛋白合成的网络的调节中也起着重要作用［12］。HSPA8在泌乳高峰阶段上调，有助于细胞骨架的形成和功能以及乳汁的产生［13］。HSP90AA1和HSP90AB1是两种主要的HSP90细胞质同种型，它们起分子伴侣的作用，并促成几种细胞过程，包括信号转导和凋亡［14］。HSP90 维持 Akt激酶活性［15］，HSP90AA1/HSPA8 的高表达与PI3K/Akt通路的激活相关，这在哺乳期间合成乳成分尤其是脂质和乳糖是重要的［16］。HSP90与STAT5相互作用并促进其活化的许多步骤［17］，后者参与乳腺发育并通过JAK2/STAT5途径控制乳蛋白表达［18］。这些HSP在高产德州驴奶样品中的表达增加，表明它们作为潜在的分子标记物的重要性，可为下一步研究其与产奶性状的关联性奠定了基础。

在哺乳期间，乳腺上皮细胞的减少导致奶产量下降。细胞数量减少归因于细胞的持续凋亡，这已被认为是泌乳后期产奶量下降的主要原因［19］。最大限度地减少细胞凋亡可以提高泌乳量［20］。本研究中，检测到的差异蛋白质，如 HSPA8、HSP90AA1、HSP90AB1、CSE1L 和KRT18，可能与抑制细胞凋亡有关。HSP90可能加强糖酵解和增殖并减少细胞凋亡［21］。HSPA8的敲除显著降低细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞生长［22］。CSE1L在大多数癌症类型中高度表达。用CSE1L siRNA处理癌细胞后，细胞活力降低，细胞凋亡增加，表明其具有抗细胞凋亡作用［23］。KRT18是另一种作为角蛋白成员的上调蛋白，与KRT8共表达，对FAS介导的细胞凋亡具有抗性［24］。在高产组中的上调的蛋白质，表明它们可能参与抗细胞凋亡作用，防止哺乳后期由细胞凋亡引起的乳腺上皮细胞数量的减少，这可能导致产奶量的增加。

总之，本研究通过非标记的定量蛋白质组学方法，对不同产奶量德州驴个体间差异表达的乳清蛋白进行了综合分析，增加了人们对驴泌乳过程中特定途径和蛋白质的认知。首次描述了乳清蛋白的表达谱，探索了与德州驴乳产量性状相关的分子机制，有助于为高产奶驴的选育筛选生物标记。