类志贺邻单胞菌耐药基因检测与耐药性关系的研究

杨 虹，苗鹏飞，谭淑雯，杨 映，吴勇亮，陈言峰，于 辉

( 佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528231 )

随着水产养殖业的快速发展，抗生素广泛使用及不正当使用，导致药物残留、细菌多重耐药和环境污染等问题日益突出[11]。类志贺邻单胞菌作为水产动物消化道炎症的新病原之一，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。通过加强类志贺邻单胞菌的耐药基因检测，进一步研究其耐药机制成为目前防治类志贺邻单胞菌的重要手段。笔者对从临床分离到的55株类志贺邻单胞菌进行耐药基因检测，并对抗生素药物的耐药性与相应耐药基因关系进行分析，从而对类志贺邻单胞菌的耐药水平做出更精准客观的评价，以期为类志贺邻单胞菌的预防和治疗及其多重耐药机制的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

试验用55株类志贺邻单胞菌分离株，分离自广东省佛山市顺德区和南海区，中山市等地区患病的鳜鱼(Sinipercachuatsi)、加州鲈(Micropterussalmoides)和乌鳢(Ophiocephalusargus)，由本实验室鉴定并保存。

1.2 主要试验试剂

营养琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；脑心浸液肉汤培养基(中国青岛高科园海博生物技术有限公司)；抗生素药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)；细菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)；DNA Marker[宝生物工程(大连)有限公司]；琼脂糖(深圳市普博科技有限公司)。

1.3 菌株培养与药敏试验

无菌条件下，挑取类志贺邻单胞菌菌株于营养肉汤培养基中，28 ℃恒温摇床120 r/min振荡培养24 h后，采用麦氏比浊法调整类志贺邻单胞菌菌液浊度为0.5麦氏比浊管浊度。采用K-B纸片扩散法进行药敏试验，测定抑菌圈大小，药敏结果以美国临床实验室标准委员会标准为判断标准。在无菌条件下用棉拭子蘸取已纯化的含有类志贺邻单胞菌的菌液，均匀地涂布于普通琼脂平板上，将药敏纸片紧贴于已接种类志贺邻单胞菌的培养基上，28 ℃恒温培养24 h，随后测量抑菌圈直径的大小，根据判读标准判别结果。

1.4 细菌DNA提取和耐药基因检测

按照细菌基因组DNA抽提试剂盒的操作说明提取细菌DNA，作为PCR模板，于-20 ℃保存。参照文献[12-14]设计β-内酰胺类、喹诺酮类和四环素类耐药基因(TEM、gyrB和tetR)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR引物序列和产物长度见表1。PCR反应体系为20 μL：无菌超纯水10 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 7 μL，上、下游引物各1 μL，细菌DNA模板1 μL。PCR反应条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s； 53 ℃，30 s；72，1 min； 72 ℃，5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 耐药基因引物序列

2 结 果

2.1 类志贺邻单胞菌的耐药性

所分离到的类志贺邻单胞菌对30种抗生素药物均产生不同程度的耐药性(表2～表3)，其中对克林霉素、万古霉素、氨苄西林、麦迪霉素、羧苄西林、苯唑西林等6种抗生素药物的耐药性较高，耐药率分别为98.2%、98.2%、90.9%、89.1%、89.1%和87.3%；对卡那霉素、丁胺卡那、哌拉西林、诺氟沙星、四环素、头孢拉定、头孢氨苄等多种抗生素药物的敏感和耐药性具有明显的菌株差异；而对头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、多黏菌素B、氧氟沙星、米诺环素和头孢呋辛等则高度敏感。值得注意的是，全部的类志贺邻单胞菌均表现为严重的多重耐药，其中有1株高达18重耐药，最少的也对5种抗生素耐药，多重耐药率为100%。

表2 55株类志贺邻单胞菌的药敏性

续表2

抗生素种类敏感率/%中介率/%耐药率/%阳性菌株数百分比/%喹诺酮类诺氟沙星65.510.923.6氧氟沙星81.814.63.6环丙沙星56.42023.6哌拉西林30.912049.11323.64氨基糖苷类卡那霉素41.836.421.8丁胺卡那74.67.318.2庆大霉素70.912.716.4新霉素69.12010.91730.91大环内酯类麦迪霉素010.989.1红霉素5.527.367.34887.28多肽类万古霉素01.898.25396.36黏菌素类多黏菌素B90.95.53.623.64硝基呋喃类呋喃唑酮96.41.81.811.82磺胺类复方新诺明16.49.174.54174.54林可霉素类克林霉素1.82098.25498.18

注：至少对1种抗生素产生耐药的菌株即为阳性菌株.

表3 类志贺邻单胞菌多重耐药检出率

2.2 类志贺邻单胞菌耐药基因的检测

TEM、gyrB和tetR基因的PCR扩增结果见图1，检测目的片段大小与预期结果一致。检测结果显示(表4)，55株菌株中10株携带TEM基因，37株携带gyrB基因以及20株携带tetR基因，携带率分别为18.2%、67.3%和36.6%；还有16株未检测到上述3种耐药基因。另外，携带1种耐药基因的有18株，占耐药菌株的46.2%；携带2种和3种耐药基因的分别占到耐药菌株的38.5%和15.4%。

图1 TEM、gyrB、tetR基因PCR电泳图M：DL2000 DNA Marker；1～3：TEM基因；4～6：gyrB基因；7～9：tetR基因；10：阴性对照.

耐药基因菌株数检出率/%TEM1018.2gyrB3767.3tetR2036.6TEM+gyrB916.4TEM+tetR610.9gyrB+tetR1832.7TEM+tetR+gyrB610.9无1629.1

通过对55株类志贺邻单胞菌的耐药基因与耐药表型检测结果比较发现，所检测的菌株对β-内酰胺类和四环素类的耐药基因与耐药表型的符合率分别18.18%和100%。然而，药敏结果显示，类志贺邻单胞菌对喹诺酮类抗生素十分敏感，但gyrB基因的检出率却很高，耐药菌株的耐药基因和耐药表型之间存在较大的差异。

3 讨 论

本研究所检测的55株类志贺邻单胞菌对30种抗生素药物均有一定程度的耐药，其中对克林霉素、万古霉素、氨苄西林、麦迪霉素、羧苄西林、苯唑西林等抗生素具有很强的耐受力，临床治疗类志贺邻单胞菌感染要尽量减少使用这些抗生素。对头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、多黏菌素B、氧氟沙星、米诺环素、头孢呋辛等抗生素则高度敏感，对卡那霉素、丁胺卡那、哌拉西林、诺氟沙星、四环素、头孢拉定、头孢氨苄等敏感性次之，表明类志贺邻单胞菌对这几种抗生素并未产生严重的耐药性，在临床防治类志贺邻单胞菌感染中可以使用，但是要避免单一使用导致类志贺邻单胞菌耐药性变异。此外，药敏试验结果显示，类志贺邻单胞菌最低的也达到了5重耐药，最多的达18重耐药，提示类志贺邻单胞菌存在严重的多重耐药，应该引起重视。同时，药敏试验结果与已报道分离的类志贺邻单胞菌不尽一致[14-17]，应该是与地域分布、环境因素差异、不同宿主以及养殖者使用抗生素的习惯不同等有关。因此在该病害的防治过程中，更应参照分离株的药敏试验结果，科学合理地使用抗生素，才能达到有效治疗的目的。

β-内酰胺类抗生素是最早、最广泛使用的一类抗生素。由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶对菌体内的窄谱和广谱头孢菌素、单环类抗生素及G-杆菌青霉素等抗生素有较好的破坏作用。有研究证实，质粒介导的β-内酰胺酶产生的耐药菌，其耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因在同种或异种菌株间转移或传播，使得更多的细菌产生耐药性[18]。本试验分离到的菌株对氨苄西林、羧苄西林、苯唑西林等抗生素耐药，但TEM基因的检出率较低，耐药菌株可能存在其他未检测耐药基因以及不同的耐药机制。因此，临床治疗应该谨慎使用各类抗生素，防止细菌携带的耐药基因被大量诱导表达，导致多重耐药。

喹诺酮类抗生素的使用量仅次于β-内酰胺类。喹诺酮类抗生素对革兰氏阴性菌的主要作用靶位点是DNA旋转酶，而gyrB正是编码DNA旋转酶B亚单位蛋白的基因[19]。gyrB基因的突变会引起靶位酶的改变，使得喹诺酮类抗生素不能正常与DNA旋转酶正常结合，因而不能阻止细菌DNA复制，从而产生耐药。本研究的55株菌株中，gyrB基因的携带率为67.3%，而且特异性条带明亮，但大部分菌株对诺氟沙星、环丙沙星等耐药性很低，耐药表型与耐药基因之间存在较大的差异，说明类志贺邻单胞菌菌株存在潜在的耐药性，可能与耐药基因的诱导性表达，或者耐药基因不表达或表达不完全相关。

四环素类抗生素的耐药机制主要为核糖体保护机制和药物外运机制，而tetR基因调控核糖体蛋白及参与药物外运的外运蛋白基因的转录和表达，且具有高度特异性和保守性[20]。当细菌的生存环境中没有四环素类药物或者其衍生物的存在时，tetR基因会与结构基因的启动子tetO结合，从而抑制四环素类耐药基因的表达；一旦四环素类药物进入细菌细胞后，便会与tetR结合致其构型发生改变，使其从tetO序列上解离下来，随之激活了四环素类耐药基因的表达[21]。本试验所检测的55株类志贺邻单胞菌中tetR基因的携带率较低，药敏试验结果显示，类志贺邻单胞菌对四环素、多西环素、米诺环素等耐药性也偏低，说明tetR基因的携带情况与耐药菌株的四环素耐药表型存在一定的相关性。

细菌耐药性与其本身特性、耐药性基因的传播以及地域、药物使用情况等因素有很大的关系。养殖水环境中和动物体内残留的抗生素对水产动物养殖带来了严重的不良影响。绝大多数细菌的耐药性是通过耐药基因产生、获得和表达来实现[22]。当抗生素残留，可以诱导细菌耐药性产生、耐药基因水平扩散或垂直传播，导致该菌对抗生素的耐药性增强，加大了该菌治疗的难度。近年来，减少进而阻止细菌耐药的传递成为广受养殖户关注的问题。本试验结果表明，类志贺邻单胞菌耐药基因和耐药表型尚未完全对应，有些菌株已检测到耐药基因，但未表现出相关耐药性；有些菌株则未检测到相应的耐药基因，却表现出较强的耐药性。因此，亟需进一步深入研究类志贺邻单胞菌的耐药机制，为防止类志贺邻单胞菌耐药性的产生和传播以及鱼病的治疗提供理论依据。