酶解柚皮生产还原糖的 工艺优化

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(1.华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070; 2.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

柚子(CitrusgrandisOsbeck),别名抛、文旦、朱栾、气柑、雷柚等,属芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)果实。柚子起源于东南亚、印度北部或中国南部一带,在我国已有三千多年的栽培历史[1]。琯溪蜜柚(Citrusgrandis(L.)Osbeck cv. Guanximiyu)原产于我国福建省漳州市平和县,因果大无核、皮薄多汁、口味香甜,称为“柚中之冠”,是我国主栽品种之一。我国柚子年产量在200万吨以上[1],琯溪蜜柚的产量占五分之二,消费后产生大量的柚皮不能被利用而污染环境。琯溪蜜柚皮的质量占整个果实的20%左右,含有水分、脂肪、蛋白质、矿物质等营养成分以及类黄酮、类柠檬苦素、类胡萝卜素、香精油和果胶、纤维素等活性成分[2],目前因尚无有效途径利用而造成资源浪费。

近年来,柚皮作为吸附剂处理废水的研究较多[3-4],主要是白皮层富含纤维素,可用于吸附染料和重金属。但目前没有解决处理废水后柚皮的办法,丢弃又会造成环境的二次污染,在实践中柚皮用于废水处理任重而道远。一些学者研究从柚皮中提取活性成分,如提取果胶、柚皮苷、膳食纤维、香精油等[5-7],这些方法需要大量的有机溶剂,提取后残渣不能被利用,造成其它营养物质的浪费。寻找对环境友好、能有效利用柚皮的生物方法显得极为紧迫,曹铭[8]用酶法制糖、发酵燃料乙醇,对加酶量、固液比等酶解条件进行优化,但未确定最佳的酶解温度和酶解时间,没有对柚皮酶解条件进行系统研究。

柚皮的主要成分是果胶和纤维素[9],还有一些半纤维素和木质素。纤维素和半纤维素中的羟基和多酚基团通过各种方式(静电吸附、络合、氢键等)紧密连接并形成了多孔的海绵层[10];果胶物质构成了相邻细胞中间层的粘结物,使组织细胞紧密粘结在一起,保持果实的水分[9],主要存在于外皮层。柚皮中其它成分如类黄酮、类胡萝卜素等,被包裹在这些多糖物质形成的特殊结构中,为了充分利用柚皮中营养成分,首先将柚皮中多糖分解成微生物可利用的单糖,通过酵母菌发酵转化成酒精,乙醇将柚皮中类黄酮、芳香物质等活性成分溶解出来,制成色香味俱佳的果酒,或将乙醇蒸馏后用作燃料,发酵后残渣还可用于动物饲料。因此,本文用果胶酶水解柚皮,以果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度和料液比为单因素,通过单因素试验确定合适的水平,根据Box-Behnken方法设计响应面试验并建立模型,优化柚皮酶解条件,将柚皮多糖最大程度地水解成还原糖,并分析各因素间的交互作用,为有效利用柚皮奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

果胶酶(酶活10000 U/g) Biosharp公司;3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、葡萄糖、盐酸、甲基红 分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;琯溪蜜柚 市售(产自福建省漳州市平和县),新鲜柚子剥皮后得柚皮,包括黄色的外皮层(flavedo)和白色的海绵层(albedo),占整个柚子质量的20.742%±3.667%。

Joyoung料理机 九阳股份有限公司;电子万用炉 北京市光明医疗仪器有限公司;AL240电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-S4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州恒岩仪器有限公司;722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;MJ33水分快速测定仪 梅特勒-托利多仪器有限公司;K9840自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柚皮中营养成分的测定方法 水分及挥发物的测定:直接干燥法[11];脂肪的测定:索氏抽提法[12];蛋白质的测定:凯氏定氮法[13];灰分的测定:总灰分的测定[14];果胶的测定:果胶酸钙重量法;粗纤维的测定:重量法[15]。

1.2.2 还原糖及总糖的测定方法 还原糖和总糖的测定采用二硝基水杨酸比色法[15]。样品预处理:称取适量的新鲜柚子皮,加一定量的水打浆后,取20～25 g浆液,精确至0.0001 g。用70%～80%的乙醇溶液作提取剂,50 ℃回流提取1 h后,用水定容至250 mL,摇匀后静置30 min。用滤纸过滤,弃去初滤液,收集滤液备用。此样液用于测定还原糖含量。

取上述滤液50 mL于小烧杯中,加入5 mL 6 mol/L盐酸混匀,68～70 ℃水浴15 min,取出迅速冷却至室温,加入2滴甲基红指示剂,用20%的氢氧化钠溶液中和至红色褪去,定容100 mL。此样液用于测定总糖含量(总糖是指具有还原性的糖和在测定条件下能水解成还原糖的低聚糖的总和,不包括淀粉)。

测定方法:取0、1、2、3、4、5、6、7 mg/mL的葡萄糖标准溶液各1 mL,分别置于干燥的25 mL比色管中,各加入3,5-二硝基水杨酸溶液2 mL,置沸水浴中2 min,显色,然后以流水迅速冷却,用水定容25 mL,摇匀。以零号管作参比,在540 nm处测定其吸光度值,绘制标准曲线,得回归方程为y=0.1478x-0.0166,R2=0.9985,其中x为葡萄糖的浓度(mg/mL),y为吸光度。取样品1 mL(含糖3～4 mg)测含量糖量，其余步骤相同，然后根据回归方程,分别计算出样品中还原糖和总糖的含量。

还原糖增长倍数(Y)=(酶解后还原糖含量-酶解前还原糖含量)/酶解前还原糖含量

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 果胶酶添加量的确定 称取适量柚皮,料液比1∶4 (g/mL)打浆,称取20～25 g浆液,精确至0.0001 g,以新鲜柚皮为干物基准,分别添加0、50、100、150、200 U/g的果胶酶,在50 ℃水浴中酶解2 h,然后测定样液中还原糖含量。

1.2.3.2 酶解时间的确定 称取适量柚皮,料液比1∶4 (g/mL)打浆,称取20～25 g浆液,精确至0.0001 g,添加100 U/g的果胶酶,酶解温度为50 ℃,酶解时间分别为0、1、2、3、4 h,然后测定样液中还原糖含量。

1.2.3.3 酶解温度的确定 称取适量柚皮,料液比1∶4 (g/mL)打浆,称取20～25 g浆液,精确至0.0001 g,添加100 U/g的果胶酶,酶解时间为2 h,酶解温度分别在20、30、40、50、60 ℃,然后测定样液中还原糖含量。

1.2.3.4 料液比的确定 称取适量柚皮,按料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 (g/mL)制成浆液,称取20～25 g浆液,精确至0.0001 g,添加100 U/g的果胶酶,50 ℃酶解2 h,测定还原糖含量。

1.2.4 响应面试验 为进一步优化柚皮的酶解条件,本试验应用软件Design Expert 8.0设计响应面试验。以果胶酶添加量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)、料液比(D)为自变量,以酶解后浆液中还原糖含量与酶解前浆液中还原糖含量相比的增长倍数Y为响应值,试验设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3 数据处理

所有试验数据重复3次取平均值,用Oringin 8.0作图,SPSS 16.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 柚皮的营养成分测定结果

从表2可以看出,柚皮中含量最多的是水分及挥发物,固形物中含量较多的是糖类物质,除还原糖等可溶性糖以外,含量较高的是果胶和纤维素。果胶含量在6%以上,比苹果渣中的果胶含量高[16],其它营养成分如蛋白质、脂肪、灰分的含量较少。因此,将柚皮中的果胶和纤维素水解成单糖是利用柚皮的前提条件。

表2 琯溪蜜柚皮的营养成分Table 2 Nutrient contents in the peel of Guanximiyu

2.2 单因素试验结果

2.2.1 果胶酶添加量的确定 从图1可以看出,随着果胶酶添加量的增加,样液中还原糖含量先增加后趋于平稳,这与曹铭[8]的研究结果一致。当果胶酶添加量从0～150 U/g时,样液中还原糖含量急剧增加;当果胶酶添加量大于150 U/g时,还原糖含量趋于稳定。这是因为加入果胶酶后,果胶被水解为半乳糖醛酸和少量的单糖[17],而且一般商业果胶酶中都含有纤维素酶,可将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖[18],使得样液中还原糖含量增加。但是随着酶添加量的增加,产物浓度增大,当反应达到平衡以后,酶的作用受到抑制[19]。因此,选择150 U/g为果胶酶的最适添加量,随着果胶酶添加量的增加,生产成本增大,响应面试验中选50、100、150 U/g为3个水平。

图1 果胶酶添加量对还原糖含量的影响Fig.1 Effect of pectinase dosage on the reducing sugar content

2.2.2 酶解时间的确定 从图2可以看出,随着酶解时间的延长,样液中还原糖含量先增加后减少,当酶解2 h时还原糖含量最多。这是因为刚开始随着酶解时间的延长,果胶酶的作用更充分[20],果胶和纤维素被水解,还原糖含量增加;当酶解时间超过2 h时,可能还原糖暴露在空气中的时间过长而被氧化,或者被其它大分子物质吸附,使得还原糖含量下降。因此,选择2 h为柚皮酶解的最佳时间，响应面试验1、2、3 h。

图2 酶解时间对还原糖含量的影响Fig.2 Effect of enzymatic time on the reducing sugar content

2.2.3 酶解温度的确定 由图3可知,在20～30 ℃的酶解温度范围内,还原糖含量上升明显;30～50 ℃的温度范围内,还原糖含量增加缓慢;当温度大于50 ℃时,还原糖含量下降。这可能是因为当温度升高时酶解反应速率加快[19],样液中还原糖含量增加;当温度超过50 ℃时,果胶酶可能被钝化使水解受到抑制[20]。因此,选择50 ℃为酶解的最佳温度，响应面试验选40、50、60 ℃三个水平。。

图3 酶解温度对还原糖含量的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the reducing sugar content

2.2.4 料液比的确定 由于加水量不同,比较不同料液比中还原糖含量,不能以酶解液中还原糖含量进行比较,按照柚皮质量换算成产生的还原糖含量。

从图4可以看出,随着加水量的增多,样液中的还原糖含量先增加后减少,料液比为1∶4时产生的还原糖最多。这可能是因为随着加水量的增多,样液中传质阻力减小[8],酶解效率提高,还原糖含量增加;当加水量继续增多,可能还原糖暴露在空气中的比表面积增大而更容易被氧化,当加水量超过4倍以上时,还原糖含量反而下降。因此,选择1∶4为料液比的最佳水平，响应面试验选料液比1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)三个水平。。

图4 料液比对还原糖含量的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the reducing sugar content

2.3 响应面试验结果

2.3.1 回归模型的建立与分析 在单因素试验的基础上,运用Design-expert 8.0中Box-Behnken试验方法,对果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度、料液比4个因素进行试验设计,每个编号的试验重复3次,结果取平均值,试验设计方案与结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计方案与结果Table 3 Experimental design and corresponding results for the Box-Behnken method

应用软件Design Expert 8.0对表3的数据进行分析,建立四元二次响应面回归方程:Y=-1.62527-0.03156A+0.62798B+0.22978C-1.35002D+2.90E-04AB+8.18E-05AC+5.04E-03AD-5.98E-03BC+0.0608BD-0.01586CD+7.97E-05A2-0.10719B2-1.80E-03C2+0.21123D2。

由表4可知,回归模型极显著(p<0.001),说明回归方程是可用的;失拟项仅为0.067,并且对应的p>0.05,说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例非常小;R2=0.9848说明预测值与实测值之间有高度的相关性。综上所述,该回归方程可用于柚皮酶解工艺的优化。由F值可以看出,影响柚皮酶解效果的各因素主效关系为果胶酶添加量(A)>酶解温度(C)>料液比(D)>酶解时间(B),并且4个因素的影响均极显著。

表4 回归模型的方差分析Table 4 ANOVA for regression model

由回归模型数据分析得到,柚皮酶解的最佳工艺条件为:果胶酶添加量150.00 U/g,料液比1∶5 (g/mL),40.30 ℃温度下酶解3.00 h,酶解后浆液中还原糖含量比酶解前增长的预测倍数为2.62。考虑到实际试验操作条件,将酶解工艺修正为果胶酶添加量150 U/g,酶解温度40 ℃,酶解时间3 h,料液比1∶5。在此条件下,酶解后样液中还原糖含量为21.76 mg/g,比酶解前增长了2.54倍,与预测值2.62倍接近,说明此试验模型可行。

2.3.2 各因素间交互作用分析 由表4可知,果胶酶添加量与酶解时间、果胶酶添加量与酶解温度、酶解时间与酶解温度、酶解时间与料液比对响应值交互作用不显著(p>0.05),果胶酶添加量与料液比、酶解温度与料液比对响应值交互作用极显著(p<0.01)。根据二次回归模型方程可以得到任意两个因素对响应值作用的响应面图,通过考察响应面的形状分析各因素间交互作用对柚皮酶解效果的影响,图5为果胶酶添加量(A)和料液比(D)、酶解温度(C)和料液比(D)的曲面图。

图5 各因素之间交互作用的曲面图Fig.5 Surface diagrams for interaction of two different factors

由图5a可以看出,果胶酶添加量和料液比的响应面坡度比较陡峭,等高线排列较紧密且呈椭圆形,说明果胶酶添加量和料液比之间的交互作用明显。由图5b可以看出,酶解温度和料液比的响应面坡度较平缓,等高线较密集但呈不规则形状,说明酶解温度和料液比之间的交互作用不如果胶酶添加量和料液比的交互作用明显,这与p值相一致。

3 结论

本文系统研究了果胶酶水解柚皮的条件,以果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度和料液比为单因素,通过试验确定合适的水平,在单因素试验的基础上,通过Box-Behnken试验方法优化酶解条件,并根据实际可操作性,得到柚皮酶解的最佳工艺参数:料液比为1∶5,果胶酶添加量150 U/g,酶解温度40 ℃,酶解时间3 h。在此条件下,酶解后样液中还原糖含量为21.76 mg/g,比酶解前增长了2.54倍,将柚皮多糖水解成还原糖,为酵母菌发酵并利用柚皮创造条件。