白花蛇舌草注射剂调节Bcl-2/CytC信号通路诱导线粒体凋亡抑制肝癌细胞增殖的研究

崔 宏，高琴琴，王效谦，万百顺，张 玲

郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)(郑州 450008)

肝癌在我国发病率较高,是我国最常见的恶性肿瘤之一,可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌源于肝脏上皮组织，是危害极大的恶性肿瘤，而继发性肝癌相比原发性较少见，一般见于其他的恶性肿瘤转移。 目前临床上对肝癌常用手术治疗,对采用局部切除同时结合放射治疗与化疗等综合治疗,但是总体预后较差。越来越多的中药被用于治疗肝癌。现代临床医学和中药学研究数据表明,白花蛇舌草注射剂具有抗肿瘤,抗氧化,抗菌,增强非特异性免疫和保护神经系统的功能，特别是在近年来，由于白花蛇舌草注射剂对恶性肿瘤和部分炎性疾病疗效显著，在临床实践中得到了广泛的应用，实践阐明，白花蛇舌草注射剂可以阻抑很多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，如成人胶质细胞瘤 U87细胞、腹水肿瘤 S 180细胞、人乳腺癌 McF-7细胞等[1]，本文以人肝癌Bcl-2细胞为探究对象，探索白花蛇舌草注射剂是否通过Bcl-2/CytC信号通路调控人肝癌HepG2细胞的增殖和凋亡,现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 选取2015年1月至2018年6月收治的120例肝癌患者临床资料进行分析，将其按照治疗方案不同分成参照组30例，研究组90例，其中研究组根据白花蛇舌草注射剂的不同浓度分为低浓度组，中低浓度，高浓度组各30例，男90例，女60例；年龄60～82岁，平均(70.6±8.3)岁；病程3～12年，平均(6.2±3.5)年，纳入标准：患者经细胞学或组织病理学检查确诊，可耐受局部药物治疗，临床依从性好；排除标准：心、肝、肾功能不全者，生物制剂过敏者，1个月内予以胸腔内注入药物治疗者。各组性别比例、年龄、病程等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法 研究组根据白花蛇舌草注射剂的不同浓度分为研究组1，研究组2，研究组3各30例，参照组不做任何处理，研究组进行体外培养人细胞癌细胞株HepG2，白花蛇舌草注射剂处理细胞后24 h和48 h分别观察细胞生长情况，逆向显微镜和透射电镜观察细胞形态，Western Blot检测 Bax，Bcl-2，Caspase-3，Cyt C蛋白表达情况。

2.1 细胞培养：HepG2细胞在含牛血清和100 (g/ml)链霉素混合物的DMEM培养基中培养，置于适宜条件的CO2培养箱中培养，每隔一天换一次液，取用对数生长期的肝癌细胞，用于实验[2]。

2.2 MTT法检测白花蛇舌草注射液对HepG2细胞增殖的影响：取对数生长期的HepG2细胞，将细胞种于96孔板中，浓度每孔180 μl，接着加入白花蛇舌草注射液20 μl,使得每孔的终浓度分别为0 (空白对照) 、25、50、100 μg/ml,对照组加入顺铂20 μl,每组设置3个复孔。将处理好的细胞置细胞培养箱中孵育(条件为：37 ℃, 5% CO2及饱和湿度)，培养24、48 h后，每孔分别加入5 mg / ml MTT溶液20 μl,振荡2 min混匀，期间注意避光,继续培养4 h,吸进孔内混合试剂,再在每个孔中加入DMSO 150 μl,至于摇台避光振荡10 min,充分混匀后,放入酶标仪中,测定每孔吸光度 (OD) 值。

2.3 倒置显微镜及透视电镜观察细胞形态：不同浓度的白花蛇舌草注射液处理后的Hep G2细胞24 h后，置于倒置显微镜下观察细胞形态的变化；白花蛇舌草注射液处理后的HepG2细胞，离心收集后，采用0. 25% 戊二醛将其固定。乙醇脱水后,采用LR White包埋,切片,醋酸铀和柠檬酸铅双染色后,镜下观察其内部结构的变化。

2.4 WB检测Bax，Bcl-2，Caspase-3，CytC蛋白表达情况：取生长状态良好的HepG2细胞，低温下提取蛋白，煮沸变性，经过电泳、转膜，一抗4℃冰箱过夜，TBST清洗，10 ming/次，二抗孵育摇床孵育1.5 h，加入显色剂，冷CCD显色。

结果

1 白花蛇舌草注射液对人肝癌细胞增殖的作用 在24 h和48 h后，浓度为50 μg/ml和100 μg/ml时，HepG2细胞的存活率明显下降。抑制率随药物浓度的增加和作用时间的延长而增加，呈剂量依赖性和时间依赖性关系，在50 μg/ml和100 μg/ml浓度下，白花蛇舌草注射液对HepG2细胞有明显的抑制作用(P<0.05)，白花蛇舌草注射液浓度为25 μg/ml时对Hep G2也有一定促进增殖的作用。见表1。

表1 白花蛇舌草注射液对人肝癌细胞增殖的作用

2 白花蛇舌草注射液对HepG2细胞形态的影响 白花蛇舌草注射液能后改变HepG2细胞的超微结构，参照组细胞核较大,细胞核清晰,有丰富的细胞器,线粒体呈圆形或椭圆形,细胞核染色质均匀分布,而当白花蛇舌草注射液剂量达到100 μg/ml时，微绒毛,胞质变性,空泡,细胞染色质固缩,边缘,有细胞凋亡的早期迹象。

3 Western blot检测蛋白表达水平 分别用低、中、高三个浓度白花蛇舌草注射液预处理HepG2细胞，24 h后，与对照组和化疗组相比，Bax、CytC、Caspase-3蛋白表达逐渐升高，Bcl-2蛋白表达逐渐降低，Bcl-2/Bax比值降低。其中,当浓度为50 μg/ml和100 μg/ml时作用最为明显,结果表明白花蛇舌草注射液可以抑制HepG2细胞的Bax、Bcl -2蛋白的表达。通过抑制Bcl-2蛋白的表达,减少Bcl-2与Bax之间的比例，释放Cyt C,激活Caspase-3相关的凋亡路径,诱导肝癌细胞的凋亡。见表2。

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h后蛋白表达的影响

讨论

肝细胞癌是一种病程短、生存时间短、预后不良的常见的恶性肿瘤,我国是一个肝癌高发的国家，肝癌死亡率是占世界上肝癌死亡率的45%。目前,治疗肝细胞癌(HCC)是手术和化疗的相互结合，寻找有效的治疗肝癌的中成药具有一定的意义，白花蛇舌草注射液已广泛应用于临床，因其疗效显著逐渐成为研究热点[3-5]。本研究显示，当白花蛇舌草注射液浓度为50 μg/ml和100 μg/ml时，HepG2细胞存活率显著下降，抑止率随药物浓度的增长和效用时间的拉长而增加，呈现出剂量和时间的依赖性关系。在50 μg/ml和100 μg/ml浓度下，白花蛇舌草注射液对HepG2细胞有明显的抑制作用(P<0.05)；在这项研究中,发现25μg/ml浓度的白花蛇舌草注射液能够促进肿瘤肿瘤细胞的生长,但是当浓度进一步增加时，白花蛇舌草注射液具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖的能力，此外，随着药物浓度和时间的增加，其抑制作用逐渐增强，且呈剂量-时间依赖性。此外，大多数抗肿瘤药物都能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡并且形态变化可以直接反映药物治疗后肿瘤细胞的变化[6-8]。在本实验中，白花蛇舌草注射液可以改变HepG2细胞超微结构,其中对照组线粒体呈圆形或椭圆形,细胞核染色质均匀分布,但是当白花蛇舌草注射液剂量达到100 μg/ml时,微绒毛,胞质出现变性,细胞染色质固缩，细胞出现早期凋亡的特征。

细胞凋亡的主要途径有以下几种，外部方法称为死亡受体途径和以线粒体为主的内部方式内源性凋亡。线粒体信号通路在调节细胞凋亡中起着重要的作用[9],线粒体的第二个主要功能就是参与细胞能量代谢,通过呼吸链来影响ATP的生成，同时与DNA损伤、细胞衰老和细胞死亡都有着密切的联系。Bcl-2家族作为凋亡相关基因在线粒体凋亡通路中发挥重要作用，关于Bcl-2家族调控线粒体外膜通透性的机制，假说之一是，细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bak发生寡聚化，从细胞质中转移到线粒体外膜上，并与膜上的电压依赖阴离子通道相互作用，使通道开放到足以使线粒体内的凋亡因子如细胞色素c等释放到细胞质基质中，引起细胞死亡[10]。本研究中Western blot结果显示白花蛇舌草注射液能够调节HepG2细胞中Bcl-2/Cyt C信号通路相关蛋白的表达，在100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml的白花蛇舌草注射剂预期处理24h后，与对照组相比，CytC、Bax、Caspase-3蛋白表达逐渐升高，Bcl-2/Bax比值也降低[11-14]。其中,100 μg/ml和50 μg/ml浓度最为显著。结果表明白花蛇舌草注射液可以调控Bcl-2蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,能够释放Cyt C,激活Caspase-3蛋白质的表达,诱导肝癌细胞的凋亡[15]，在这项研究中,我们发现白花蛇舌草注射液可以有效的调节Bcl-2，Bax，Caspase-3蛋白质的表达，使Caspase-3蛋白质逐渐增加并且使Bcl-2蛋白表达逐渐降低，从而诱导肝癌细胞的凋亡[16]。

综上所述，白花蛇舌草注射液能够抑制人肝癌Hep G2细胞的增殖并且能够诱导其凋亡，这可能与Bcl-2 /CytC信号通路的调控有关。