乙型肝炎的研究现状以及未来展望

王泉宇

【摘要】    根据世界卫生组织的数据显示，虽然已经有安全有效的抗病毒药物与高效的保护性疫苗，慢性乙型肝炎仍然是一个重要的公共卫生问题。在目前的治疗条件下，完全治愈几乎不可能，终生治疗往往是必须的。近些年来对乙型肝炎病毒生命周期和宿主免疫反应的新认识，使药物治疗的目标靶点进一步扩展，使乙肝的治疗有了更多的可能性。然而，在平衡功效和安全性的同时创造协同效应仍然是一个明显的挑战。本篇文章回顾了各种联合治疗方法，强调了每种潜在策略的优势和挑战。总的来说，联合治疗是治疗的下一步，是实现有限持续时间和持久终点治疗的关键策略。

【关键词】    乙肝    药物治疗

一、背景：

乙肝即乙型病毒性肝炎，是由乙型肝炎病毒（HBV）所引起的一种传染病。临床表现为乏力、黄疸、消化道症状、肝脾肿大、肝区疼痛、肝掌及蜘蛛痣等，并可能引起并发症（慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等），在临床上是常见的感染性疾病。此病广泛流行于世界各国，全球约有2.57亿人感染乙型肝炎病毒，主要感染者为儿童和青少年。此病为我国危害最大，流行最广泛的一种传染病。

HBV是DNA病毒，有双链、环形、不完全闭合的基因组。该病毒通过与感染者的血液或其它体液接触传播。如果HBV在人体内持续复制，将会导致肝脏病变，甚至会发展为肝癌、肝硬化等严重疾病，给患者的身心健康造成极大的伤害。

HBV DNA是cccDNA（共价闭合环状的双链DNA），cccDNA作为转录所有病毒RNA的模板，包括前基因组RNA（pgRNA）因此在病毒生命周期中发挥关键作用。cccDNA有两种来源：传入的病毒离子和从肝细胞胞质中回收包被的DNA。cccDNA的半衰期较长，因此解释了为什么HBV感染很难治愈以及为什么HBV可以在清除乙肝表面抗原（HBsAg）多年后，自发地或在免疫抑制后重新激活。

二、HBV感染的流行情况

全球有2.57亿人，占全球人口的3.5%有HBV感染。非洲和西太平洋地区占感染者的68%。世界卫生组织（WHO）估计，在2015年，全球有将近134万人死于乙肝。不经治疗，HBV和丙型肝炎病毒（HCV）感染可导致肝硬化（72万人死亡）和肝癌（47万人死亡）。病毒性肝炎的死亡率自2000年以来已上升了22%。在2015年，全球普通人群HBV感染率为3.5%，患病率最高的地区是非洲（6.1%）和西太平洋地区（6.2%）。2015年，乙型肝炎导致88.7万人死亡，大多死于并发症（包括肝硬化和肝细胞癌）。

三、HBV感染

慢性HBV感染过程可以根据血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）浓度、血清中HBV DNA水平和乙型肝炎e抗原（HBeAg）状态这三种临床参数分为四个阶段：第一个阶段的特征是存在HBeAg，血清中拥有高水平HBV DNA，但是ALT水平正常。它被称为“免疫耐受”阶段。[1]

在ALT水平升高时，就来到了免疫耐受期之后的“HBeAg阳性免疫活性”阶段。经过变化的时间间隔，发生了从HBeAg到乙肝e抗体的血清转换，而且大多数病人转换到了“非活性载体”阶段，在此期间，ALT水平恢复正常，并且血清HBV DNA水平很低或者不可检测。在一些患者中，经过数年或者数十年的治疗之后，血清HBV DNA和ALT水平再次升高，这些患者被认为进入了“HBeAg阴性免疫活性”阶段。

有些患者自发清除了HBsAg，但这种情况很少见，每年只有0.5%-1%的发生率。大部分清除了HBsAg的患者的血清中检测不到HBV DNA，但在部分患者的血清中和所有患者的肝脏中都存在HBV DNA。

四、乙型肝炎病毒治疗现状

慢性乙型肝炎的最终临床结果需要检测：生化（ALT标准化）、病毒学（抑制血清HBV DNA）、血清学（HBeAg和/或HBsAg丢失伴或不伴随血清转化成乙型肝炎e抗体和抗HBs）和组织学的（肝纤维化病人中炎症坏死是否会改善）标记物。它们被用作临床结果：肝硬化、肝失代偿、肝癌的评估依据。

五、药物治疗

最近的重大科学发现使人们能够更好地了解乙肝病毒的生命周期，主要有两类抗病毒疗法被批准用于治疗乙型肝炎：干扰素和NAs。当下药物治疗的原理可以分为以下：识别乙肝病毒进入的细胞受体、有关参与CCCDNA形成的关键核酶及其表观遗传学控制的信息、观察干扰素（IFN）或核因子JB信号诱导的部分CCCDNA降解，以及乙肝x蛋白（HBX）在HBV转录中的作用。

5.1阻止病毒进入细胞的抑制剂可根据其作用方式分类

1.中和抗体靶向结合HBV S区抗原环或前S1区的N端抗原表位。这些抗体具有高度的特异性，但需要经非消化道（不能吃，需要静脉注射）给药，大量的抗体对中和循环的亚病毒包膜顆粒是必要的。

2.附着抑制剂是结合病毒（例如肝素）或细胞硫酸肝素蛋白多糖（例如聚赖氨酸）的负电荷或正电荷药物。

3. 牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）的底物包括结合胆盐（例如牛磺胆酸盐、依泽替米贝（降血脂药））和其他由NTCP运输的小分子;对受体高浓度和短半衰期的要求限制了它们的临床应用。

5.1.1核酸（NA）

NA对cccDNA缺乏影响。链终止型NAs阻断了pgRNA对HBV DNA的逆转录，但对CCCDNA的产生、稳定性或转录影响很小。cccDNA和整合病毒基因组的持续转录可能解释了尽管无法检测到血HBV DNA水平，但在NA治疗期间血清HBsAg水平下降相对较小[2]。不幸的是，目前对HBsAg的循环检测还不能区分HBsAg和CCCDNA的转录和HBV DNA的整合。

5.2靶向cccDNA

5.2.1伤害性抑制

许多研究表明，尽管CCCDNA位于肝细胞核的保护区内，但仍有可能以其为靶点。对培养的肝细胞的研究表明，几种细胞因子（IFN-A、淋巴毒素-B受体激动剂、IFN-C和肿瘤坏死因子-A）都可以调节导致apobec3a/b脱氨酶上调的途径，进而诱导CCCDNA的非肝毒性降解。然而，在这些组织培养研究中只实现了部分降解。DNA裂解酶，包括归巢内切酶或巨核酸酶、锌指核酸酶、TAL效应核酸酶和Crispr相关（Cas）核酸酶，特别针对CCCDNA，正在实验模型中进行探索。

一些研究表明，用Crispr相关（Cas）核酸酶切割HBV DNA比用apobec介导的胞嘧啶脱氨基更有效。在进行临床试验之前，需要解决这些基因编辑方法对HBV感染的肝细胞的有效传递，而不会产生非预期的靶向效应。

5.2.2功能性抑制

病毒CCCDNA被组织成染色质样结构，受表观遗传调控，表观基因组修饰剂可能阻断CCCDNA转录活性和抑制病毒蛋白的表达;但是，如果不是特定的，它们可能对宿主细胞产生有害影响。一些细胞因子，如IFN-A已经在临床前模型中证实其通过表观遗传修饰降低了CCCDNA转录。HBX已被证明是通过降解SMC5/6限制因子进行CCCDNA转录和病毒复制所必需的;因此，HBX可能是一个有吸引力的病毒靶点，不仅沉默CCCDNA转录，而且沉默其他的一些具有HBX蛋白依赖性的病毒相关的细胞相互作用。目前检测CCCDNA的方法缺乏特异性，需要一种标准化的方法来检测CCCDNA或CCCDNA转录。

5.3 IFN基因激动剂

IFN基因的刺激因子是很多胞内DNA受体的辅助蛋白，同时它也是细菌第二信使的识别受体，可以作为天然免疫的潜在药物靶点。IFN基因激动剂也可以作为治疗或预防的辅助药物。维甲酸诱导蛋白1不仅可以诱导干扰素和细胞因子的产生，还可以通过检测PGRNA的ε结构来抑制HBV的复制。

sb 9200是二核苷酸sb 9000的口服前药，被认为能够激活维甲酸诱导蛋白1和核苷酸结合寡聚化域c。含有蛋白质2，导致IFN介导的病毒感染细胞的抗病毒免疫反应和土拨鼠血清中的肝炎病毒DNA和表面抗原水平下降。

5.4检查点调控

慢性乙型肝炎缺乏T细胞介导的应答部分是由于共抑制受体（包括程序性细胞死亡、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4淋巴细胞激活基因和粘蛋白域）过度表达而损害T细胞效应器功能所导致的。白细胞介素10等免疫抑制因子也可能损害T细胞功能。最近的癌症治疗表明了用抗体阻断这些共抑制受体的潜力。这种抑制可能逆转乙型肝炎的免疫功能紊乱，这一点在伍德查克的研究和人类的体外研究中得到证实。这种方法的主要关注点是诱导可能导致致命的器官损伤的不受控制的肝炎爆发和自身免疫。

5.5治疗性疫苗

治疗性疫苗接种的目的是刺激或增强宿主免疫反应，恢复免疫控制，从而持续抑制HBV复制，最终导致HBsAg丢失。对传统的疫苗进行评估，其效果都比较有限。病毒载量高的患者反应性可能较低，肝硬化患者免疫介导的肝炎发作的风险较高。采用NAS预处理抑制HBV复制，可增强HBV特异性T细胞反应，预防耀斑。

5.6抑制HBV进入

HBV感染首先通过其大包膜蛋白（HBL）与细胞硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）的相互作用附着在肝细胞表面，[3]随后，HBL前S1区与NTCP、肝特异性胆盐转运体和最近确定了HBV的细胞受体。HBV与其受体的结合触发了一种小窝蛋白-1介导的内吞作用，将病毒内化为肝细胞。[4]HBL与宿主细胞受体和进入因子之间相互作用的特异性破坏将选择性地抑制HBV感染，并在多组临床试验中得到证实。桃叶珊瑚苷B为一种一流的乙肝病毒和丁型肝炎病毒（HDV）进入抑制剂，具有很好的临床应用前景。

除此之外，胆盐类似物和环孢菌素A衍生物，也已被证明能结合NTCP并抑制肝细胞的HBV和HDV感染。然而，它们的抗病毒作用尚未在体内动物模型中得到证实。使用NTCP基质类似物抑制HBV/HDV感染的一个主要问题是NTCP生理功能潜在干扰胆汁酸肠肝循环。有趣的是，由于NTCP中HBV/HDV感染和胆汁酸转运的必需氨基酸残基重叠，但不完全相同，因此有可能开发出NTCP靶向药物，专门抑制HBV和HDV感染，而不损害NTCP转运胆汁酸的功能。[5]

5.7以多功能HBV聚合酶蛋白为靶点抑制HBV DNA复制

与包含逆转录酶（RT）域和核糖核酸酶H（RNase H）域的经典逆转录病毒逆转录酶不同，HBV聚合酶在其N末端区域有两个附加域，一个末端蛋白域（TP）和一个间隔域。独特的结构特征是HBV聚合酶在病毒DNA复制中的附加功能。[6]

具体来说，HBV聚合酶在病毒性前体PGRNA的5区域结合一个干环结构ε，以促进PGRNA和聚合酶自身被包装成核衣壳。在核衣壳内，聚合酶通过催化位于其TP结构域的酪氨酸羟基残基与作为模板的dGMP之间形成磷酸二酯连接，启动病毒DNA负链的合成。啟动反应仅在三个核苷酸合成后终止，随后在dr1序列转移到PGRNA的3端继续进行。

负链DNA向PGRNA的5端的延伸。PGRNA同时被聚合酶的RNase H结构域降解，但其5端区域（包括5dr1）除外，后者被转移到负链DNA的dr2区域以促进正链DNA的合成。显然，HBV DNA聚合酶在包装PGRNA、启动和延长病毒DNA合成以及降解病毒PGRNA中起着重要作用。经细胞核苷激酶激活后，核苷酸可与天然核苷酸底物竞争，结合到DNA引物中并拉长DNA链，终止病毒DNA合成。

5.8核蛋白壳装配的抑制

如上所述，HBV DNA复制发生在核蛋白壳内。因此，抑制核蛋白壳组装将阻止病毒DNA复制。有趣的是，一个复制能力强的核蛋白壳的装配依赖于细胞hsp90伴侣复合物辅助的HBV DNA聚合酶折叠和与PGRNA结合，从而触发120个核心蛋白二聚体的补充，将PGRNA聚合酶复合物包装成二十面体核蛋白壳。

因此，抑制hsp90的功能和阻断或破坏病毒聚合酶、PGRNA和核心蛋白之间的相互作用应该能抑制核蛋白壳的装配，从而抑制HBV感染。

5.9抗病毒和免疫调节疗法的结合

为了达到HBV“治愈”的目的，可能需要联合针对HBV生命周期中多个步骤的抗病毒治疗，以抑制病毒复制和病毒抗原产生，并通过免疫调节疗法恢复对HBV的免疫应答。因为大多数临床评价中的抗病毒或免疫调节药物正在进入第i期或第ii期试验，目前还不确定是否需要。

六、讨论：

近年来人们对乙型肝炎病毒生命周期和宿主免疫反应的有了新认识，对于乙肝治疗的药物靶點也随之增多，多种治疗的方式使乙肝治疗的可能性随之提升。同时，由于疫苗的大范围使用以及民众卫生水平的提升，对乙肝病毒的传播得到了有效抑制。但中国作为一个乙肝大国，当下仍然面临着严峻的危机。

对于全世界而言，开展的多种治疗手段相关研究虽然仍面临着巨大挑战，但抗病毒和免疫疗法的结合是乙肝治愈的一个大的可能性。

参  考  文  献

[1] Lok， A.S.， et al.， Hepatitis B cure： From discovery to regulatory approval. J Hepatol， 2017. 67（4）： p. 847-861.

[2] Seto， W.K.， et al.， Reduction of hepatitis B surface antigen levels and hepatitis B surface antigen seroclearance in chronic hepatitis B patients receiving 10 years of nucleoside analogue therapy. Hepatology， 2013. 58（3）： p. 923-31.

[3] Schulze， A.， P. Gripon， and S. Urban， Hepatitis B virus infection initiates with a large surface protein-dependent binding to heparan sulfate proteoglycans. Hepatology， 2007. 46（6）： p. 1759-68.

[4] Macovei， A.， et al.， Hepatitis B virus requires intact caveolin-1 function for productive infection in HepaRG cells. J Virol， 2010. 84（1）： p. 243-53.

[5] Tang， L.， et al.， The current status and future directions of hepatitis B antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov， 2017. 12（1）： p. 5-15.

[6] Seeger， C. and W.S. Mason， Molecular biology of hepatitis B virus infection. Virology， 2015. 479-480： p. 672-86.