急性药物性肝损伤血清miR-122与肝损伤指标相关性研究

古巧燕， 王会丰， 李 敏

延安大学附属医院消化科，陕西 延安 716000

近年药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)发病率在世界范围内有明显上升趋势，成为全球第五大死亡原因，由于我国人口庞大，临床药物种类繁多、不规范用药等特殊性，DILI的发病率在我国仅次于病毒性肝炎和脂肪肝。可见早期预防、诊断、治疗DILI对于改善DILI转归尤其重要，但DILI的诊断目前仍然主要依靠明确用药史基础上出现肝脏生化指标异常，缺乏特异性诊断指标，同时病情发生、发展转归评估也缺乏有效指标评价。miR-122是一种最早发现的肝脏特异性miRNA，不仅参与肝细胞发育、表型分化代谢和应激过程，还参与嗜肝病毒感染、炎症性肠病、癌症发生、非酒精性脂肪肝等许多病理疾病的发生、发展过程[1-10]，有研究也显示，其与DILI有相关性[11]，在众多DILI相关的血液生物学指标中具有敏感性高、特异性好、稳定性高的特点，有很大的临床应用价值，但关于miR-122的研究大多数处于各种不同的动物实验与临床前期研究阶段。因此本研究立足于此，通过制备急性药物性肝损伤(acute drug-induced liver injury, ADILI)动物模型研究寻找血清miR-122与肝损伤指标的关系，进一步探讨血清miR-122在ADILI中的价值，为ADILI的早期诊断、监测评估病情、合理治疗、预后评估等方面提供一些思路。

1 材料与方法

1.1主要试剂和设备RNA提取试剂盒(tiangen，DP433)；SYBR®Premix Ex Taq(Takara，RR820A)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，RR047A)；miR-122引物(Ribobio，s170407125461)；RNA提取试剂盒(tiangen，DP433)；对乙酰氨基苯酚(A105808 阿拉丁)；7080型全自动生化分析仪(HITACHI)；DEPC(Diethyl pyrocarbonate，上海阿拉丁生化，D105557)；荧光定量PCR(Applied biosystems，Stepone plus)(Applied biosystems，Veriti)。

1.2实验动物和分组选用6～8周龄C57雄性小鼠，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场,许可证号：SCXK(苏)2017-0001，在标准环境下饲养，随机分为模型组15只和对照组15只；对照组小鼠给予200 μl生理盐水灌胃1次，模型组小鼠给予质量浓度为25 g/L的乙酰氨基酚混悬液200 μl灌胃1次(450 mg/kg)[12]；24 h肝穿验证模型，分别于灌胃前后不同时间点采集血液(0、1、4、8、16、24、48、96 h)，完善相关指标的检测。

1.3生化指标及miR-122检测应用全自动生化分析仪检测血液门冬氨酸氨基转移酸(aspartate transaminase, AST)、丙氨酸氨基转移酶(cerealthirdtransaminase, ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)；应用逆转录实时荧光定量PCR方法测定血液miR-122、U6：应用PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒逆转miR-122，逆转录试剂包括样本RNA 1 μg、反应缓冲液5×Primescript Buffer 4 μl、反转录酶5×Primescript RT Enzyme Mix 2 μl、Bulge-loop RT Primer 2 μl、DEPC水13 μl，逆转录条件为42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。以U6为内参基因，进行实时定量PCR，反应体系为cDNA 2 μl、miRNA上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、miRNA下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、SYBR Green solution10 μl、去离子H2O 7.2 μl；反应条件：95.0 ℃，10 min，40个PCR循环(95.0 ℃ 2 s；60.0 ℃ 20 s；70.0 ℃ 10 s)。数据采用相对表达量ΔCt表示。

1.4组织学染色鉴定模型灌胃第24 h[13]给实验动物进行肝穿，取肝脏组织，制作切片，进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织病理变化。

2 结果

2.1ADILI模型组和对照组生化指标及miR-122检测结果ADILI模型组和对照组分别于0、1、4、8、16、24、48、96 h时进行了ALT、AST、ALP、TBIL、miR-122 (ΔCt)的检测，详见表1～2。

表1 ADILI模型组各指标检测值Tab 1 Detection value of each index of the ADILI model group

表2 对照组各指标检测值Tab 2 Detection value of each index of control group

2.2ADILI模型验证结果ADILI模型组与对照组24 h时血清AST和ALT差异性比较(t=15.59、10.30,P<0.05)。

模型组肝组织HE染色显示，肝细胞出现水样变性，细胞内肿胀疏松，胞浆伊红染色偏淡，视野内散在炎症灶，肝血窦间大量出血，细胞弥漫性坏死(见图1)。

2.3ADILI模型组与对照组血清miR-122差异性分析

ADILI模型组不同时间点血清miR-122检测值与对照组血清检测值进行差异性比较，8、16、24、48 h 4个时间点两组小鼠血清miR-122水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其余时间点两者水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

图1 两组组织学染色结果 A：对照组(100×)；B：ADILI模型组(100×)；C：对照组(400×)；D：ADILI模型组(400×)Fig 1 Histological staining in two groups A: control group (100×); B: ADILI model group (100×); C: control group (400×); D: ADILI model group (400×)

组别 只数 0 h 1 h 4 h 8 h# 16 h# 24 h# 48 h# 96 h对照组 15 5.06±0.57 4.78±0.59 4.60±0.38 4.89±0.86 5.18±0.67 5.22±0.51 5.27±0.52 4.60±0.52模型组 15 4.89±0.70 4.73±0.44 4.80±0.61 3.38±0.49 2.42±0.41 3.51±0.49 3.84±0.59 4.39±0.58t值 0.74 0.26 1.05 5.81 13.80 9.50 7.15 1.05

注：与对照组比较，#P<0.05。

2.4ADILI模型组血清miR-122与ALT相关性分析ADILI模型组不同时间点血清miR-122检测值分别与ALT检测值进行相关性分析，结果表明，8、16、24 h时3个时间点模型组血清miR-122水平与ALT水平呈正相关(P<0.05)，其余时间点两者之间无相关性(P>0.05)(见表4)。

表4 ADILI模型组血清miR-122与ALT相关性

注：两指标比较，#P<0.05。

2.5ADILI模型组血清miR-122与AST相关性分析ADILI模型组不同时间点血清miR-122检测值分别与AST检测值进行相关性分析，结果表明8、16、24 h时3个时间点模型组血清miR-122水平与AST水平呈正相关(P<0.05)，其余时间点两者之间无相关性(P>0.05)(见表5)。

2.6ADILI模型组血清miR-122与ALP相关性分析ADILI模型组不同时间点血清miR-122检测值分别与ALP检测值进行相关性分析，结果表明，在不同实验观察时间点模型组血清miR-122水平与ALP水平无明显相关性(P>0.05)(见表6)。

表5 ADILI模型组血清miR-122与AST相关性分析

注：两指标比较，#P<0.05 。

表6 ADILI模型组血清miR-122与ALP相关性

2.7ADILI模型组血清miR-122与TBIL相关性分析

ADILI模型组不同时间点血清miR-122检测值分别与TBIL检测值进行相关性分析，结果表明在不同实验观察时间点模型组血清miR-122水平与TBIL水平无明显相关性(P>0.05)(见表7)。

表7 ADILI模型组血清miR-122与TBIL相关性Tab 7 Correlation between serum miR-122 and TBIL in the ADILI model group

3 讨论

DILI是指由各种类处方或非处方的化学药物、生物制剂、传统中药、天然药、保健品、膳食补充剂及其代谢产物乃至辅料等所诱发的各种肝损伤[14-17]。药物引起的急性肝脏损伤,其严重程度轻重不一，往往由于早期缺乏特征性的临床表现和生物学指标监测，会导致病情加重发展为急性肝衰竭、慢性肝炎、肝纤维化、慢性肝内胆汁淤积等，使死亡率和肝移植率明显升高，影响了人群健康生活水平。可见早期有效的诊断、评估病情进展风险、监测ADILI病情发生、发展、预后，对于制定合理有效的预防治疗方案，改善ADILI发生及预后至关重要。

随后人们对miR-122进行了广泛深入的研究，研究结果越来越多显示，miR-122与嗜肝病毒感染、肝癌等许多肝脏疾病有着密切关系[18]，SZABO等[19]研究显示，miR-122与肝损伤程度、ALT水平相关，可作为DILI的早期血浆标志物，由于药品的多样性和个体的差异性、药物反应的复杂性，miR-122和ADILI的关系仍然多处于实验与临床前期研究阶段。鉴于血清、肝脏miR-122与DILI的复杂关系，本研究立足于探讨ADILI血清miR-122与肝损伤指标的相关性。首先，我们通过乙酰氨基酚混悬液灌胃法制备ADILI模型，对实验小鼠肝脏组织进行HE染色病理观察，同时检测造模第24 h模型组和对照组血清ALT与AST的水平，发现两组小鼠ALT和AST水平差异有统计学意义，模型组血清AST、ALT水平明显高于对照组，血清AST、ALT水平升高是临床肝细胞损伤的一个经典指标，提示ADILI模型制备成功。其次对模型组和对照组血清0、1、4、8、16、24、48、96 h 8个不同时间点血清miR-122的表达水平分别进行了比较，结果显示8、16、24、48 h 4个时间点模型组血清miR-122明显升高，两组水平的差异有统计学意义，其余时间点差异无统计学意义。可见ADILI初期8 h前和后期48 h后，血清miR-122水平较对照组无明显变化，间接提示血清miR-122的监测时间段应该控制在8～48 h。SU 等[13]研究显示，ADILI模型血清miR-122在给药后3 h开始升高，48 h后开始下降；王雁等[20]研究显示，模型动物血清miR-122在给药1.5 h后开始升高，24 h达到峰值，96 h下降至正常；WANG 等[11]研究显示，给药后1 h miR-122出现了升高。本实验的研究结果与这些实验结果有所不同，不排除造模方法以及急性肝损伤模型分型、肝脏炎症程度等因素不同导致，有必要进一步扩大模型样本及排除肝损伤分型及严重程度差异后进一步探索。最后，本实验对0、1、4、8、16、24、48、96 h 8个不同时间点ADILI模型组血清miR-122水平与肝损伤指标ALT、AST、ALP、TBIL水平进行相关性进行分析，一方面结果显示，在8、16、24 h时3个时间点内ADILI模型血清miR-122表达水平与ALT、AST水平存在正相关，随着血清miR-122水平的升高，血清AST、ALT表达水平也呈升高趋势，提示血清miR-122水平在8、16、24 h 时3个时间点与肝损伤指标血清AST、ALT的变化趋势一致，间接推测ADILI血清miR-122水平升高预示着肝细胞损伤的加重，此结果与王雁等[20]研究ADILI模型血浆miR-122与肝脏血清转氨酶变化趋势基本一致的实验结果的部分相符合；此外其余时间点血清miR-122水平与ALT、AST水平研究结果显示无明显相关性，后期可以进一步检测肝脏组织中miR-122表达，从不同研究角度进一步深入研究。另一方面本研究结果显示，在研究设置观察的8个时间点内血清miR-122表达水平与ALP、TBIL水平无明显相关性存在，数据同时显示在本实验中ADILI模型组血清ALP、TBIL水平无明显升高趋势，考虑是否与本实验ADILI动物模型的病理损伤部位有关，血清ALP、TBIL水平升高与胆汁淤积性肝损伤关系密切，有必要通过制备肝细胞性、胆汁淤积性和混合性不同病理类型的药物性肝损伤模型，深入反复研究ADILI血清miR-122表达水平与ALP、TBIL水平的相关性。

总之，血清miR-122表达水平与ADILI有着密切关系，随着肝损伤病情发展呈现出不同的变化趋势，与肝损伤指标ALT、AST有很好的相关性，由于血清miR-122自身又具有敏感性特异性高，稳定性好的特点，我们有必要进一步调整造模方法及加入血清miR-122干预试剂等深入研究，探讨不同ADILI病理类型、严重程度、病情发展变化及疾病转归中血清miR-122的特征性变化趋势，寻找血清miR-122变化的早期观察时间点及水平界限，为临床上寻找ADILI早期诊断、病情风险预后评估、治疗方案优化的新靶点提供一些思路。