循环外泌体miRNAs在结直肠癌中的标志作用和临床转化中的挑战

刘学娟 甘海宁 张丽妹 徐学虎

引言

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指从细胞膜脱落或由细胞分泌的囊泡状小体，几乎可由所有细胞类型释放。EVs 至少可分为外泌体（exosomes）和微囊泡（shed microvesicles，sMVs）2类，其中外泌体是胞内多泡小体与质膜融合释放的一大类EVs，直径约30～150 nm，而微囊泡是从质膜直接出芽形成的EVs，直径约50～1 300 nm。EVs 携带了供体细胞的癌蛋白/多肽、多种RNA（如microRNA、mRNA 和lncRNA）、脂质和DNA片段等生物活性分子，主要介导细胞与细胞、细胞与微环境之间的信息交流［1］。因外泌体的形成及其内容物的分选机制更具特异性，且能在循环中相对稳定存在等特点［2-4］，外泌体成为最被广泛关注的一类EVs。

循环miRNAs 是“液体活检”的重要组成部分，包括了游离和囊泡中miRNAs，早期研究并未严格区分两者。之后的研究证实了游离miRNAs 只占少部分且不稳定，血液中被囊泡（特别是外泌体）包裹的miRNAs 才是循环miRNAs 主要来源［5］。外泌体miRNAs 作为肿瘤基质-肿瘤细胞间信号交流的重要媒介，几乎参与了肿瘤发生、转移的全部生物过程［1，6］。是一类有希望的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点。

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是三大恶性肿瘤之一，我国CRC 综合发病率和死亡率分别排第三和第五位，总体仍呈现持续上升趋势［7-8］，缺乏敏感而特异的早期预警标志物是CRC 发病率和死亡率持续上升的重要原因。循环外泌体miRNAs 丰度较高、稳定性好，且更容易标准化，有望成为CRC 早筛早诊、病情监测、疗效评估的新型生物标志物［9-10］。本文从循环外泌体miRNAs相关生物学特性、在CRC 中的生物标志物作用、血液样本收集及预处理相关注意事项、临床转化的挑战和研究局限、未来展望等几个方面进行论述。以期能够为本领域的研究者们提供参考。

1 循环外泌体miRNAs 相关生物学特性

外泌体miRNAs 在血液循环中之所以能稳定存在的原因有二：一是因为外泌体纳米级别的直径大小可以避免被吞噬，二是因为外泌体本身携带CD47、CD55 和CD59 等分子，可避免被循环单核-巨噬细胞清除而稳定存在［11-12］，miRNAs 有囊泡膜的保护，可免受体液中的酶类降解［13］。

外泌体在肿瘤转移中被称为“探路者”，确定转移方向、传递转移信号、促进肿瘤细胞迁移、诱导上皮-间质间转化、营造转移前微环境和传播转移恶性行为［14］，而外泌体miRNAs 以前体miRNAs（precursor miRNAs，pre-miRNAs）和（或）成熟miRNAs 形式分选入多泡体中，并通过多种机制被受体细胞接纳，并在受体细胞中发挥其对靶基因的调控作用［7］。目前在ExoCarta（http：//www.exocarta.org）网站上记录的外泌体miRNAs 已经有2838 条信息［15］。

2 循环外泌体miRNAs 在CRC 中的生物标志物作用

2.1 早期诊断标志物

多项综述和荟萃分析阐述了循环miRNAs 在CRC 早期检测中的潜在作用［16-18］。在肿瘤中研究最多的诊断标志物之一为miR-21。Yu 等人［19］的荟萃分析纳入了9 项研究，共有746 例CRC 患者和476 例健康者，汇总后发现miR-21 对CRC 的诊断敏感性和特异性分别是72%和85%，提示其在CRC 中具有良好的诊断标志物潜能。多个miRNAs 作为组合或miRNAs 联合其他生物标志物用于CRC 早诊筛查，可以提高其检测效能。一项荟萃分析纳入了24 项研究，包括1 558 名CRC 患者和1 085 名健康者的循环miRNAs 的检测结果，使用随机效应模型分析纳入的循环miRNAs 对CRC诊断效能的总体水平，这些循环miRNAs 对CRC的诊断敏感性和特异性分别为81%和84%。而将单一miRNA 和miRNAs 组合研究纳入亚组分析，结果显示，与单一miRNA（敏感性和特异性都为78%）相比，miRNAs 组合在CRC 中具有更高的诊断敏感性（84%）和特异性（87%）［20］。另一项研究也表示miRNAs 组合具有更高的准确性，在早期CRC 患者中敏感性可高达90%，特异性高于80%［21-22］。然而，在探究CRC 循环外泌体miRNAs表达谱时发现miR-1246 和miR-23a 的灵敏度可分别高达95%和92%，提示血液中外泌体来源的miRNAs 可能更具有成为CRC 的诊断标志物的潜能［23］。

2.2 预后预测标志物

循环miRNAs 作为预后生物标志物在早期和晚期CRC 患者中均有显著价值。有研究分析Ⅰ～Ⅳ期CRC 患者血清中miR-21 的表达，发现其与CRC 生存率显著相关［24］。Fesler 等［25］在评述中汇总了miR-92a、miR-92c、miR-21、miR-141、miR-200c、miR-181b 等指标与CRC 的淋巴转移或远处转移相关，可作为CRC 的预后指标。Ferracin 等［26］的分析了已报道的20 余个在CRC 患者中显著差异表达的循环miRNAs，发现这些miRNAs 在CRC 循环中的表达水平随肿瘤的恶化进程而变化，恶性程度越高miRNAs 表达差异倍数越大，可以作为CRC 的风险监测和预后预警标志物。miR-29c 有望成为CRC 早期复发（局部复发或切除后1年内远处转移）的风险监测指标［27］。循环miR-1290、miR-122 和miR-203 的水平可能对早期CRC 患者有预后意义，miR-203 还与转移性CRC 的预后差密切相关［28-30］。血清外泌体miR-19a 过表达可以预测CRC 复发［31］。血浆外泌体miR-21 可用作预测不同TNM 分期CRC 患者复发和不良预后的分子标志物［32］，相关研究较多，充分体现了循环外泌体miRNAs 在CRC 中具有不同层面的预后价值。

2.3 治疗反应/疗效评价标志物

奥沙利铂是转移性CRC 的一线化疗药物，研究表明循环中miR-106a，miR-484、miR-130、miR-27b，miR-148a，miR-326 等分子可能作为奥沙利铂化疗方案治疗CRC 的疗效评价指标［33］。有些外泌体miRNAs 可能有KRAS 依赖性，如miR-100 在KRAS 突变型患者的外泌体中上调，提示这类miRNAs 可能参与CRC 靶向治疗的耐药产生［34］。检测CRC 治疗前后循环miRNAs 差异表达水平可能预示着CRC 对治疗的反应/疗效情况［35］。目前阐明循环外泌体miRNAs 在预测CRC 对化疗和靶向药物反应性和疗效中的作用研究相对较少，但探寻CRC 的治疗反应/疗效评价标志物对临床医师制定决策具有重要的指导意义。

综上，循环外泌体miRNAs 作为CRC 的诊断、预后预测、风险监测、疗效评价等生物标志物是非常有希望的。但很多研究结论存在广泛的不一致，一个重要原因是存在样品选择偏倚、运输和处理不当、血细胞污染等问题［36］。所以，血液样本收集和处理标准化很关键。

3 血液样本收集及预处理

根据液体活检在临床肿瘤诊疗应用的专家共识［37］推荐，血液样本一般非空腹状态下采集肘部静脉血，建议不少于10 ml，排除凝血功能障碍、免疫缺陷疾病等患者，避免样本凝血、溶血等情况。若是采用EDTA-K2 抗凝管：采血后轻柔颠倒8～10次，即时冰浴送检。若需获得血浆标本，建议2 h内完成两步离心。第一步低温（4℃）条件下，先以1 900×g，离心10 min，去除细胞或细胞碎片吸取上清；第二步以16 000×g，离心10 min，进一步除去残留细胞碎片。血浆标本可保存于-80℃冰箱或直接抽提进行实验。若是Streck 型采血管则可室温保存3～5 天，7 天内进行上述方法分离储存即可。若需获得血清样本，可待血液自然凝固后取上清，再参照上述两步离心法处理并储存。

标准化的样品处理至关重要，血液中血细胞，外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和血小板等衍生的miRNAs 都将显著影响循环miRNAs 的水平，样本处理不当引起的溶血或血小板活化都将改变血液样品中的miRNAs。有研究也建议根据美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）早期检测研究网络（the Early Detection Research Network，EDRN）的方案，将全血样品立即处理成血清或血浆［25］（https：//edrn.nci.nih.gov/）。此外，血清中各种因子和其他污染物也可影响miRNAs 的定量。应注意不同的miRNAs 本身表现出不同的稳定性，在处理的过程中有不同降解程度，导致miRNAs之间的比例变化［38-39］。控制这些因素对结果造成的偏倚是循环miRNAs 临床转化中的一大挑战。

4 循环外泌体miRNAs 临床转化的挑战和研究局限

尽管很多实验数据表示循环外泌体miRNAs在肿瘤中扮演重要角色，但其在临床实践中仍面临诸多挑战。除上述提到的样本收集和预处理的非标准，还缺乏数据标准化方案［36］，入组的患者数量往往有限，更普遍的原因是缺乏临床获益的明确证据［40］。主要体现在循环外泌体miRNAs 肿瘤特异性差；实验室间差异大，结果重复性差；循环外泌体纯化鉴定困难和外泌体形成及内容物分选机制不明确等方面。

4.1 循环外泌体miRNAs 肿瘤特异性差

miRNAs 肿瘤特异性问题是临床实践中的一大挑战。一项关于循环miR-21 的研究发现CRC、乳腺癌、肺癌、食道癌和胃癌患者的血清miR-21 均高表达［41］。同样，外泌体miR-10b 也参与乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的进展［42-44］。Leidner 等［45］发现13 种miRNAs 可作为乳腺癌的候选生物标志物，但其中10 种被发现在其他肿瘤类型中显著差异表达。这些研究证明miR-21、miR-10b 等分子不是任何一种癌症类型特异的，是广谱肿瘤标志物。甚至一些miRNAs 的差异表达都不是肿瘤特异的，在应激反应、炎性增生等变化中也存在显著差异［46］。

4.2 实验室间差异大，结果重复性差

循环miRNAs 研究领域另一挑战是结果重复性低。He 等人［16］在搜集了25 项相关研究进行荟萃分析，共纳入2 146 例CRC 患者和1 267 例健康对照者，发现了78 个差异表达的循环miRNAs。然而被大部分研究验证到的靶标也只有寥寥几个，只有miR-21、miR-29a、miR-15b 等表达量高者。另一项研究在乳腺癌中发现158 个差异表达的候选miRNAs，其中有16 个在2 个研究中重叠，但没有一个miRNA 在3 个研究中重叠［45］。研究之间显著的差异性可由多种因素造成，如：单个miRNAs 验证的样本数量相对较少、样本来源类型不同（血浆、血清与全血）、检测技术和使用的参比标准不同等［40］。

外泌体的研究表示，使用WB、ELISA 和粒径方法鉴定肿瘤患者和非肿瘤患者血浆样本来源的外泌体，二者存在显著差异［47］。而另有研究表示，在多种肿瘤类型中，与非肿瘤的个体相比，血浆或血液中循环EVs 或微粒水平均没有统计学差异［48］。这种截然相反的结果可能部分原因是由样品采集或囊泡计数方法的差异导致［1］。实际上，有人建议应使用粒子数与蛋白质浓度的比率来解决实验室间EVs 测定的差异［49］。当然，只有随着技术方法的标准化和规范化才能减少数据的不一致性。

4.3 循环外泌体纯化鉴定存在疑问

外泌体纯度不高可能是样品采集、预处理、储存和运输过程不规范或囊泡计数的实验方法差异导致。在临床血液样本中测定EVs（包括外泌体）水平的另一个关键影响因素是血小板产物的水平。血小板来源的EVs 占据血液中EVs 的最大比率，并且这些血小板EVs 的水平随年龄、疾病负荷和感染等疾病状态而显著变化［50］。此外，脂蛋白颗粒，蛋白质复合物和类似EVs 大小的其他微粒在血液中占比都可能高于EVs［49，51-52］。目前外泌体的纯化方法主要是以超速离心为代表的各式离心法和以试剂盒为代表的免疫亲和沉淀法，鉴定方法主要是针对外泌体的直径大小和其携带蛋白的特点做定性测定，有WB、ELISA、粒径、流式检测等。这些纯化和鉴定的方法依然存在很多的局限和疑问，不能很好的把外泌体从复杂的循环中纯化鉴定出来，更不能满足临床转化需求。

有些研究者也致力于生产临床级GMP 外泌体。Kalluri 博士等人［53］生产出具有靶向致癌Kras能力的工程化外泌体（iExosomes）。并在体外体内研究中证实了这种iExosomes 能够抑制kras，增加胰腺癌小鼠模型的存活率。该研究建立了一套临床级治疗性外泌体生产、质检等操作流程，为外泌体在其他类型疾病的治疗应用中奠定了基础。但目前这些工程化技术还只在少数实验室中进行探究。

4.4 外泌体形成及内容物分选机制不明确

目前EVs 分离方法和亚群异质性区分还存在很大的挑战，虽然研究者们更关注外泌体，实际上外泌体为何更重要还未能从分子机制层面解释。目前的研究揭示了外泌体的生成、摄取和载物分选都涉及内涵体分选复合体（ESCRT complex）及相关蛋白［54］，而Dicer、Ago2 和TRBP 参与了外泌体miRNAs 的加工分选［55-56］。热休克蛋白HSP90也能刺激外泌体的释放，有助于含有潜在毒性蛋白的外泌体扩散到周围环境导致疾病传播［57］。但是，这些关键分子具体是如何调控外泌体形成和miRNAs 等内容物分选，还有哪些重要分子参与这一分子机制等问题都有待深入探究。

4.5 外泌体作为治疗载体的潜能和挑战

外泌体是人体的天然囊泡递送系统，因其理想的粒径大小及生物膜相容性，作为肿瘤的治疗载体或药剂具有很大的潜能。有研究通过将可注射水凝胶装载间充质干细胞来源的外泌体用于后肢缺血的治疗并取得了不错的效果［58］。Kalluri 博士等［53］通过电转将靶向KRAS 突变的siRNA 导入成纤维细胞来源的外泌体中生成iExosome。iExosome 经过体内运输到达癌细胞处，将含siRNA 的内容物递送至癌细胞，激活相关通路，最终抑制肿瘤的增殖和转移。目前已有几种基于EVs 的靶向药物递送系统在癌症、丙型肝炎、神经退行性病变，炎症疾病等中展现了巨大的潜能［59］。但外泌体载体在体内驻留时间和稳定性尚值得探讨，优化外泌体应用策略是提高外泌体利用率的有效方式。

5 小结和展望

循环外泌体miRNAs 是循环miRNAs 的主要来源，在样本收集和预处理、生物标志物作用、临床转化挑战、研究不足等方面存在很多共性。目前由于外泌体纯化鉴定等挑战的存在，循环外泌体miRNAs和循环miRNAs 2 方面的研究是交融的，本文一并进行了阐述。循环miRNAs 在2008年就已经发现，历经10年余的发展，它依然是研究热点却没有在临床中得到实践，这说明它具有强大的潜能，同时又存在很多的不足和挑战。循环外泌体miRNAs 具备一定的肿瘤特异性和液体活检的简便性，在结直肠癌中具有作为早期/辅助诊断、预后预警、复发风险监测、疗效评价等生物标志物的潜能。但众多的研究存在血液样本收集和处理不规范、miRNAs 肿瘤特异性差、结果重复性差、循环外泌体纯化鉴定等方面的不足或挑战。目前有很多新的仪器设备和技术方法正在推进循环外泌体miRNAs 的转化应用。

随着数字PCR、微流控芯片等新兴技术对实验方案的不断优化，相信不久在循环miNRAs 领域将会制定出更加规范统一的标准来解决miNRAs的定量不准、重复性差等问题。随着外泌体形成机制和miRNAs 在循环中的调节机制的不断揭示，循环外泌体miRNAs 的肿瘤特异性和标志物潜能将被进一步挖掘，相关临床转化也将顺利推进，也许未来的医者通过简单的血液测试就可以识别对治疗反应差的患者或发现需要治疗干预的目标人群，这对指导临床治疗选择意义重大。

此外，随着光学/电子显微镜以及微纳米技术取得的新突破，已经能够分离并分析单个（亚）囊泡的膜结构和功能异质性。相信未来对EVs 异质性，亚群分型的研究将更加细致。此外，实验室的数据已经显示iExosomes 可以经过体内运输到达癌细胞处，将含siRNA 的内容物递送至癌细胞，影响肿瘤的增殖和转移，相信通过临床转化策略进一步完善，未来将有可能通过修饰外泌体携带更多有效的治疗靶点，靶向外泌体miRNAs 的治疗手段也将得到有效验证。