仪器分析技术在检测神经递质释放中的应用

(首都医科大学中心实验室,北京 100069)

囊泡主要集中在每个神经元的突触前神经末梢。它们储存神经递质并在动作电位使突触前膜去极化时，神经递质释放后与突触后膜上的受体结合，释放的神经递质的种类决定了下游神经元是去极化还是超极化。在胞吐作用后，囊泡发生内吞，再循环并重新填充神经递质。已知囊泡表面的蛋白就有大概40种左右[1]，参与其释放的蛋白也有很多种，这些分子蛋白相互作用，高度有序，并且受到了精密控制[2]。其失调可导致许多身体和心理的疾病，如帕金森病，阿尔茨海默病，抑郁症,药物成瘾和癫痫。研究神经递质释放的过程，不仅会对神经生物学基础理论研究产生积极的影响，也将揭示与其相关的重大疾病理论机理，为其治疗提供新的靶点。

1 目前研究方法

1.1 电镜

电镜方法主要用于测量囊泡的一些物理特征，比如说囊泡的大小，分布，密度和形态。透射电子显微镜(TEM)是用于描述囊泡特征的最普遍的技术，在透射电镜中，聚焦的电子束通过薄样本传输以产生样本图像。处理样品的重金属如四氧化锇和醋酸铀使脂质膜产生对比。TEM具有卓越的分辨率。另外，TEM还可与免疫标记(免疫EM)结合，以提供分子特征[3]。扫描电子显微镜(SEM)是研究囊泡的一种成熟且有用的技术.扫描电镜通过用聚焦的电子束扫描囊泡表面来观察囊泡; 电子与样品中的原子相互作用，产生各种可诱导信号，提供三维表面形貌信息以及样品的元素组成。主要用于研究胞外的囊泡[4]。由于绝大多数关于囊泡的扫描电镜的研究是在真空下进行的，因此样品通常是固定和脱水的。冷冻电子显微镜(cryo-EM)是电镜的一种形式，其中样品在非常低的温度(例如，-100℃)下进行分析.与需要大量样品固定和染色的SEM或TEM不同，冷冻电镜在冷冻条件下分析样品中囊泡，避免受到脱水和化学固定剂的影响[5]。

1.2 光学

由于荧光染料的开发和显微成像技术的发展，使用光学方法检测囊泡实时释放的应用越来越多[6,7]。FM1-43是研究囊泡释放的常用的膜表面荧光标记物,其在水相中不发荧光, 插入脂质膜后则产生较强的荧光, 因此囊泡释放后细胞的膜表面荧光强度增加, 而囊泡胞吞时因为吞进周围的染料而被荧光标记,这样便能够实时观察递质释放的过程，此方法背景荧光较大。另一种背景荧光小的方法是通过转基因将荧光基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞并选择性地在囊泡膜上表达[8]。Yulong Li等最近通过在乙酰胆碱，多巴胺和去甲肾上腺素受体特定位置嵌入循环重排的荧光蛋白，当神经递质释放后，作用到受体时，激活的受体构象就会发生变化，构象的变化就会导致荧光蛋白的荧光信号发生改变，进而反映对应神经递质的浓度变化。Lin Tian小组也开发了类似的探针。这种传感器不仅在监测神经递质释放方面具有高度选择性，而且在体内和离体模型中也提供了非常高的时间(亚秒)和空间分辨率(从全脑切片到单个神经元)[9-11]同时克服了基于G蛋白偶联受体的传感器在体内使用的一些限制[12]。并且应用范围从单细胞到在体清醒模型都可以。

全内角反射荧光显微镜(Total Internal Reflect Fluorescence Microscopy, TIRFM)方法的原理是利用光在高折射率和低折射率的交界面，当入射角达到或超过某个临界角度时，发生全反射形成隐失场，使用隐失场激发荧光样品，激发的厚度大概只有100nm，其它的荧光基团不会被激发，因此信噪比很高，特别适合神经递质释放和内吞方面的研究应用。

1.3 电学

1.3.1膜电容

膜电容方法是通过膜片钳放大器记录细胞膜表面积的变化来估算刺激的细胞胞吐所引起电容变化的方法。膜电容与细胞的表面积成正比，当分泌的囊泡与胞膜融合时，膜电容增加。此方法主要用于单细胞和组织切片，用于检测标本的范围比较窄。

1.3.2突触后电流

此方法就是利用释放的神经递质作用到突触后特异性受体引起电流来研究神经元递质释放。快的兴奋性和抑制性递质如谷氨酸，γ-氨基丁酸(GABA)，和乙酰胆碱可以直接激活离子通道，记录到突触后细胞或膜片的电流。这个技术被广泛的用于研究脑组织中GABA 和谷氨酸释放的调节，自发性的突触后电位频率与动作电位诱发的递质释放的概率有关[13]。

1.4 电化学技术

电化学技术的原理是:给予电极表面一定的电压,容易氧化的神经递质就会在电极表面发生氧化反应而释放电子,电极获得电子并产生电流。由于碳的电化学特性稳定，材质坚韧，且原材料容易获得，也容易加工成直径小的纤维(5～35 μm)，对组织损伤小，因此电化学电极原料大多为碳。

碳纤电极：电化学方法在生物体的应用主要是恒压安培法和循环伏安法。前者的优点是时间分辨率高, 后者的优点是能区分不同的信息分子。1973年Adams等将碳电极植入麻醉大鼠的大脑中，并且证明了传统的伏安法可以应用于生物组织。尽管当时所记录的信号可能是抗坏血酸而非多巴胺，但这项工作的重要性是证明了神经递质可以扩散到突触间隙外的电极表面，如果这种情况不存在，在体电化学测量是不可能的[14]。在这之后，该技术被广泛应用，电化学方法用于脑片中的神经递质测量始于上世纪70 年代，而应用于单细胞递质分泌测量则是在90年代Wightman小组完成[15]。而在进入20世纪后，Wightman小组又率先实现了自由活动状态的大鼠的多巴胺记录[16]。电极可以分为柱状电极和点状电极。柱状电极主要应用于在体和脑片，检测的是很多囊泡的释放，空间分辨率达不到单个囊泡的水平。点状电极主要应用于单细胞，无论是时间(毫秒)还是空间分辨率(单囊泡)都能保证对分泌囊泡数量、单个囊泡的容量等研究的需要[17,18]。

酶修饰电极：由于碳纤电极只能检测可以被氧化的神经递质，主要是多巴胺和去甲肾上腺素，但有很多重要的神经递质不能被500～700mV的电压所氧化，通常通过对电极表面固定特定的氧化酶从而形成H2O2来完成分析物检测。例如，主要兴奋性神经递质谷氨酸的检测可以通过谷氨酸氧化酶来实现，谷氨酸氧化酶将谷氨酸转化为α-酮戊二酸和H2O2[19]。由于酶的动力学可以减慢这种测量的时间分辨率，因此基于酶的传感器通常与安培法联合。已经开发了许多种基于安培法的酶的传感器，包括谷氨酸[19]，乙酰胆碱[20]及其前体胆碱[21]和腺苷[22]。

1.5 微透析-高压液相色谱-电化学检测方法

微透析(Microdialysis)：微透析技术是将灌流取样和透析技术结合用于活体组织动态微量采样的技术。其原理是将具有透析作用的探针埋入目标组织内，用微量注射泵以恒定速度向探针内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液，与待测的组织进行物质交换后被引流出。联合高压液相色谱检测技术便可检测特定组织内生物活性物质的变化。此技术具有活体取样，定量分析，动态监测等优点。

高压液相色谱(high pressure liquid chromatography, HPLC)色谱法又称层析法，是常用的分离物质的方法。其原理为溶质在流动相和固定相之间进行的连续多次交换过程。由于溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。根据各组分在固定相中保留时间不同，就可以定性定量检测神经递质。

2 讨论和应用

电镜技术是神经元中递质释放的传统研究方法，电镜的空间分辨率是其它方法无法企及的， Bernard Katz根据记录到的终板电位的固定振幅的小的自发去极化，提出了量子假说[23]。 然而，只有在电镜中看到突触囊泡才使其量子假设细化为囊泡假说。另外Palade提出的囊泡运输假说也是根据电镜结果得出的[24]。需要以纳米分辨率成像的膜和蛋白质的研究，离不开电镜方法。与免疫电镜相比，最近的超微结构研究利用可切换的荧光蛋白质将电子显微镜和超分辨率显微镜结合成像(称为纳米-fEM)[25],大大提高了标记的灵敏度。

通过光学的方法，可以直接实时动态观察到荧光标记的分泌囊泡。这样就可以看到囊泡释放的一系列进程。在最近的一项研究中，Kylachko及其同事利用高荧光强度苯乙烯基染料SGC5，检测了自发的或由动作电位诱发的染料摄取后单个突触囊泡的运动轨迹[26]，发现自发的释放引起内吞的囊泡的活动范围比动作电位引起的内吞的囊泡更小。另外，荧光蛋白可以通过电穿孔，病毒注射或基因组整合来表达，从而可以稳定和长期表达，用于长期监测神经元活动。 另外还可以通过使用特异性启动子或定位序列来实现靶向神经元亚型或细胞器。总之随着染料和显微镜以及图像传感器的发展，光学的方法越来越受到科研工作者的青睐。

电学方法也可以用来实时检测囊泡的分泌，该技术的优点是对囊泡释放的时间分辨率高。兴奋性突触后电流和抑制性突触后电流常用来检测谷氨酸和氨基丁酸的释放，但此方法是突触前释放的神经递质作用到突触后受体的综合结果，本质上是一种间接的方法，而且受到神经递质的扩散和消除，受体失敏和受体饱和等影响。从突触后反应中获得突触前行为需要复杂的反卷积算法，这些算法依赖于对实验条件的假设。另一个常用的电学方法膜电容测量则是对囊泡释放的直接测量。常用来研究递质释放与离子通道以及细胞内第二信使的关系。此方法为研究囊泡的活动如膜融合动力学、膜融合的分子调控等提供了强大的工具。但由于胞吐同时伴随胞吞，胞吞导致的囊泡膜的回收会使膜电容减少。此方法还有一个假设就是囊泡内含有神经递质，囊泡完全与胞膜融合以及囊泡内的神经递质完全释放，但已经证实还存在其它的释放方式。还有就是此方法对实验条件如封接电阻(Rm)、串联电阻(Rs)的要求很高, 对于一些复杂结构如神经轴突终末、或与周边细胞有电学偶联的细胞等则不能使用该技术。总体来说电学的方法虽然具有高分辨率的优势，但都主要应用在单细胞或脑片层面上，用于在体研究神经递质传递的比较少。

在体脑内神经递质的研究主要依赖于微透析-高压液相色谱和电化学微电极检测方法。通过微透析结合高压液相色谱来采样和测定脑内神经递质的变化，其分析过程比较长，样品收集时间间隔为5～30分钟。时间分辨率比较低，无法实时测定脑内神经递质浓度的变化。它的优点在于它的很高的灵敏度和分辨率，缺点在于它的时间和空间分辨率不够高。这些年电化学微电极发展也取得了很大的进步，在在体水平和脑片水平上以及单细胞水平上都能记录多种神经递质的释放。时间和空间分辨率都优于微透析-高压液相色谱。

现在很多关于神经递质的研究都是结合多种方法，例如在有些蛋白丢失其功能的情况下，囊泡的分布会发生变化，同时其动力学也可能会发生变化，这时候电学结合电镜或光学的方法就会使时间和空间分辨率都很高[27]。而如果囊泡的大小发生变化，除了电镜观察囊泡的直径外，还可以测突触后电流或用微碳纤电极来进一步验证。2018年Shin W研究囊泡释放动力学就用到了电容，电镜和光学[28]。而Zhou Zhuan 实验组最新发现的一种新的不依赖于钙离子的分泌方式也涉及到了电容，电镜和全内反射显微镜等多种研究方法[29]。这些方法的结合可以相互弥补各自的缺点，同时又相互印证。