人野生型S100A10原核表达载体的构建、蛋白表达纯化及鉴定

王德利,尹显贵，杨 华，李 赫

(1.吉林大学生命科学学院,吉林 长春130012；2.中国人民解放军联勤保障部队 第964医院，吉林 长春130062； 3.吉林大学口腔医学院，吉林 长春130021)

S100A10又被称为p11，属于S100家族成员，是一种钙离子结合蛋白，在细胞内外发挥多种功能[1]，与膜联蛋白A2(ANXA2)形成异源四聚体AIIt中被发现[2]。在生理状态下AIIt定位在细胞的内膜及外膜上，其中外膜上的AIIt为纤溶酶原(plasminogen)和组织纤溶酶原激活剂(tPA)提供锚定位点[3]，是调控肿瘤细胞迁移与转移的关键蛋白复合体，被认为是肿瘤治疗的一个潜在靶点。有文献研究表明，当S100A10与ANXA2形成复合体时，其半衰期增加，而在不与ANXA2结合时会被泛素化降解[4]，因而在细胞中的丰度较低，这为研究其功能带来了困难。同时，由于S100A10同源二聚体结构的特性，其N端和C端都参与了AIIt的形成，即与ANXA2 N端的相互作用。因此，为了能进一步研究S100A10蛋白的功能及以其为靶点进行药物筛选，我们利用大肠杆菌表达体系表达并纯化了不带有标签的野生型S100A10蛋白，并通过Western Blot及ANXA2-GST融合蛋白pull-down实验进行鉴定。

1 材料

菌株：DH5a感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；BL21(DE3)感受态细胞为本实验室保存。

载体：pEXS-DH原核表达载体改造自pET-28a，为中科院生物物理所孙飞组惠赠。

DNA聚合酶fast pfu购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific公司。

S100A10鼠单抗购自Cell Signaling公司；ANXA2鼠单抗购自Santa Cruz公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自Pierce公司。

2 方法

2.1 野生型S100A10原核表达载体的构建

以人肝癌细胞HepG-2的cDNA为模板，设计以下引物：P11_F:5’-ccgCATATGCCATCTCAAATGGAACACGCC-3’(NdeI),P11_R:5’-ccgCTCGAGCCttaCTTCATGTGTACTACAAAA-

TAGTCATT-3’(XhoI)。其中在反向引物中人为加入了终止密码子，确保翻译后的蛋白质C端与野生型相同。利用标准的PCR技术扩增出目的片段，产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切目的片段及pEXS-DH空载体，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收。用T4 DNA连接酶按片段/载体摩尔比3:1室温连接双酶切产物2 h，连接产物转化DH5a感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的琼脂糖平板，于37℃恒温培养箱中培养过夜。挑取单克隆扩大培养提取质粒，进行双酶切鉴定，结果为阳性的送测序。

2.2 野生型S100A10的原核表达

将测序结果正确的S100A10重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆在37℃进行扩大培养。待OD达到0.6时将摇床降温至16℃，加入终浓度0.4 mM的IPTG进行诱导，继续16℃培养20 h，进行S100A10蛋白的表达。

2.3 野生型S100A10的初步纯化

由于本实验中设计表达的野生型S100A10表达量大且不带有标签，因此采用硫酸铵沉淀法进行第一步纯化。4℃ 4 000 g离心30 min收集菌体，用0.1M Tris,100 mM NaCl Buffer pH7.5重悬，加入终浓度0.1 mg/ml的溶菌酶，超声裂解。裂解后4℃ 20 000 g离心30 min，收集上清。在上清中加入硫酸铵固体，同时在冰上搅拌，直至硫酸铵不再溶解，冰上搅拌6 h，让蛋白质充分沉淀。4℃ 10 000 g离心30 min,收集沉淀，用2 ml 0.1M Tris,100 mM NaCl Buffer pH7.5溶解沉淀，20 000 g离心30 min,取上清加入终浓度18%饱和度的硫酸铵，冰上搅拌过夜，用相同的方法处理后浓缩至2ml，用Superdex75 分子筛进一步纯化。

2.4 野生型S100A10的精细纯化

将初步纯化后的样品上样Superdex75 分子筛，利用Bio-Rad Duoflow蛋白纯化系统进行精细纯化，收集保留体积大于14 ml的组分，在12% SDS-PAGE检测目的蛋白纯度。

2.5 纯化后S100A10的功能鉴定

通过验证纯化所得S100A10能否与ANXA2结合来验证其部分功能。利用纯化的C端带有GST标签的ANXA2(ANXA2-CG)与S100A10冰上孵育1 h，挂GST亲和层析柱(柱A)；先将ANXA2-CG挂GST柱，而后再向柱子中加入纯化所得的S100A10(柱B)。取AB两柱中等量的GST介质制成电泳样在12% SDS-PAGE上检测。

3 结果

3.1 野生型S100A10原核表达载体的构建

我们成功扩增出了大小约为280 bp的目的片段，最终测序结果显示载体构建正确。见图1。

A.PCR产物经1%琼脂糖电泳的结果；B.双酶切鉴定结果

3.2 利用硫酸铵沉淀法初步纯化野生型S100A10

首先将全蛋白沉淀用1/15M Na2HPO4-KH2PO4pH5.5 buffer稀释至100 ml,分别各取2 ml加入到不同浓度的硫酸铵溶液中，4℃摇床上轻摇过夜，进行硫酸铵梯度浓度筛选。次日10 000 g离心30 min，取沉淀用pH7.5 buffer溶解，20 000 g离心30 min，取上清经12% SDS-PAGE检测目的蛋白纯度。由于S100A10异源二聚体分子量为22kd，为了后续能够进行分子筛纯化时保证其与大分子量杂蛋白的分离度，硫酸铵最适浓度为15%-20%饱和度之间，因此我们选择18%饱和度的硫酸铵作为沉淀条件进行纯化。见图2。

上图为硫酸铵浓度梯度筛选结果，下图为用18%饱和度的硫酸铵进行纯化后的结果

3.3 利用Superdex 75对S100A10进行精细纯化

通过分子筛结果我们发现，S100A10在分子筛上峰尖位置与预测一致但峰形较宽，为了保证精细纯化后蛋白的纯度，舍弃与大分子量杂蛋白同时流出的部分，最终纯化结果如图3。

3.4 与ANXA2-CG的pull-down实验

我们采用两种挂柱方式来验证纯化后S100A10与ANXA-CG的结合能力，并通过Western Blot进行了蛋白鉴定。结果显示两种挂柱方式都能让纯化后的S100A10与ANXA2-CG结合，且等量ANXA2-CG结合的S100A10蛋白量不同，这与我们的实验预期相符，同时说明两者的结合是特异性的相互作用。见图4、5。

4 讨论

S100A10蛋白异源二聚体分子量仅为22kd，但其结构较为精细，二聚体上包含有钙离子结合位点[5]、AHNAK结合位点[6]、SMARCA3结合位点等[7]功能区域，更重要的是二聚体中一分子S100A10的N端与另一分子S100A10的C端一起组成了ANXA2 N端结合口袋，盲目的在S100A10 N端或C端添加纯化用标签都可能影响其与ANXA2结合的功能，在本实验室的前期工作中我们表达并纯化了C端带有8*His标签的S100A10，结果发现其可溶性较差且不会与ANXA2-CG结合。

上图为经18%饱和度硫酸铵沉淀纯化后的S100A10在Superdex 75分子筛上的层析图。下图为收集器中每管样品经12%SDSPAGE后考染结果，利用已纯化好的ANXA2(分子量36kd)在同一根上Superdex 75进行排阻层析作为对照(层析图未放入)。

上图为两种pull-down方式的模型示意图；下图为用AB两柱GST介质制成电泳样经12%SDS-PAGE后的考马斯亮蓝染色结果及Western Blot结果。

因此我们构建了不含有标签的S100A10表达载体，并依照S100A10蛋白的性质进行纯化实验设计。

考虑到野生型S100A10的等电点为5.5，在纯化初期我们先用偏中性的buffer(pH 7.5)将裂解液上清中全蛋白尽可能的沉淀下来，而后用pH为5.5的buffer溶解沉淀并再次进行硫酸铵沉淀，在降低目的蛋白溶解度的情况下，尽可能的除去杂蛋白，为后续的高效液相色谱纯化提供纯度较高的样品，达到了很好的纯化目的。和S100A10相比，S100家族其他成员也具有等电点偏酸性，分子量小，二体化，配体结合位点多等特点，因此本实验技术对于纯化其他S100家族蛋白也具有重要的参考意义。

黑色为S100A10的N端和C端，白色为ANXA2的N端(PDB ID:4HRE)。