浅谈DGGE技术在食品微生物研究中的应用

魏晓恒

摘 要：DGGE（变性梯度凝胶电泳）是在含有从低到高的线性变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的特异性双链DNA片段的电泳。通过电泳， DNA片段移动到高浓度的变性剂中。当双链的DNA在最低变性的标准下，完成最低浓度的变性剂时，形成部分断链状态，从而减慢其迁移速率。当产生这种变性时，就会发生序列特异性。所以，DGGE在理想的状态下，就可以分解成均匀的DNA片段。这种分子标记的方式，有非常显著的效果。它已广泛应用于生物多样性调查、遗传关系鉴定、基因突变检测等专业，在这篇文章中，对DGGE技术的概念，以及研究食品微生物的作用，都进行了总结，为我国食品安全的发展提供理论依据。

关键词：DGGE技术;双链DNA;基因检测

中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）04-0215-02

0 引言

我们日常生活中的每一种食物，都会包含着不同的微生物。而我们日常生活中，对食物最普遍的污染就是食品微生物污染。目前的科学界中，食品微生物污染专业，以及食品卫生专业，他们主要研究的领域就是，对食物中微生物生活的环境以及其群体结构，有害微生物的测试。在针对微生物种群结构研究方面，变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electro—phoresis，DGGE）技术，是现在科学界中最关键的一种生物学方式。这个技术是在1979年，由Fischer和Lerman提出的，它是一种专门针对于DNA突变电泳，来进行测试的方法。这个方法的的使用，将传统琼脂糖凝胶电泳，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳的测试，其准确程度提高到了一个核苷酸残基的地步。在研究微生物的种群结构时，1993年Muyzer等人，将DGGE电泳测试方法运用到了里面。他们认为在对自然界中，微生物种群的繁殖和差异性进行研究时，使用这种方面在各方面都对其有利。DGGE技术在研究微生物分析生态学方面，已经得到了普遍的应用，其主要特点在于，能够精准、迅速的对自然或者人工环境中，微生物的群落进行判断，还可以微生物种群的繁衍、物种的兴衰、基因等方面，进行分析研究。在这篇文章中，对DGGE技术的概念，以及研究食品微生物的作用，都进行了总结。

1 DGGE技术基本原理及操作流程

1.1 基本原理

采用聚合酶链反应（PCR）扩增DNA片段，分子量的变化、稳定、中等，以及其16S 核糖体RNA，或者是18S 核糖体RNA。扩增之后的DNA片段，其大小是一样的，但是排布的规律是有区别的。在进行解离和变性凝胶时，不一样的DNA片段，因为其特征的差异而被分解。由于G、C、A、T4碱基在DNA片段中，其排布的规律存在差异，所以双链DNA分析其温度上（tm），也存在一定的差异。低浓度变性剂下链接低TM DNA分子，在浓度高的变性剂下，就会链接高TM DNA分子，假设每组碱基都存在差异，那么浓度存在差异的变性剂，就要提供给碱基对一样的双链DNA分子。当变性剂的浓度适宜时，双链DNA分子的链就会分解，而链停顿的越久，其在移动的过程中受到的阻碍就越多，DNA分子的电泳迁移率越低。当迁移电阻与电场力处于均衡的状态，在浓度梯度发生变化的凝胶中，DNA分子就可以存活，所以，存在差异的DNA分子，就是变成独立的条带。

1.2 操作流程

实施DGGE这项技术完整的顺序如下：（1）采集不同的食物;（2）从样品中提取和纯化总DNA或RNA;（3）可变区PCR或RT-PCR扩增;（4）预实验（DGGE条件优化）;（5）DGGE凝胶的制备;（6）S的DGGE分析;样本;（7）光谱分析;（8）对条带的分布规律进行研究。这里面在研究的食物中，必须要先将总DNA进行提纯，其中最重要的环节就是对产品进行设计，以及对PCR进行扩增。以上就是对DGGE技术的实行。

1.3 特点

实行DGGE技术的原理，首先16S核糖体RNA的引物，对增大一些细菌必须有显著的效果，然后从实验的食物中，提取出微生物基因组DNA，来进行特异性PCR扩增，然后将增大之后的微生物，使用DGGE技术来解离判断，以此来对微生物进行研究。DGGE法是研究细菌群落结构最常用的分子生物学方法之一，它不需要培养，检测限低，测试的效果明显，成本低，结果精确，使用的范围非常的广泛。凝胶条带0/1矩阵、峰矩阵、亮度矩阵分析凝胶图样，共同构成了DGGE凝胶分析法。在使用DGGE凝胶分析时，不同的条带对实验的精确会产生干扰，特别是在分析微生物的种群时，这种干扰更加明显。

任何分析生物学的方法都不可能是完美的，都有需要完善的地方，DGGE技术也不例外，在分析DNA片段时，DGGE技术只能完成一部分，针对微生物的群落中，不到1%优势的种群，其在分析过程中还存在一定的誤差。DGGE技术在进行解离时，对大片段没有任何作用，这对系统的分析、获取排布规律的信息，都产生了一定的阻碍。针对实验对象的选取各方面而言，要求极其严苛，如果稍有疏忽，分布规律存在差异的DNA片段，就会一起进行移动。种类各异的DNA片段，分布的地方是一条DGGE带，对研究对象的分析，存在一定的误差。

2 DGGE技术在食品微生物研究中的应用

2.1 食品微生物的多样性分析

现在的科学界中，研究食品微生物的方法有很多中，其中最为关键的就是DGGE技术，它对测试研究对象的微生活种群是至关重要的，在所有的微生物研究中，得到了普遍的使用。聚类分析（UPGMA）表明不同来源的样品中微生物组分的相似性和相关性。样品电泳图谱中的条带数目可以反映不同样品间群落的相似性。通过计算群落相似系数，就能够发现生物种群之间的不同之处。在对微生物的种群结构进行研究时，PCR-DGGE技术得出的结果是非常精确的，也给食物的安全提供了保障。在水产品、酒类、发酵食品、肉制品等行业，得到了普遍的使用。

郑炯、夏雪娟、叶秀娟等人利用聚合酶链反应-聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术研究了竹笋的盐度为5g/100mL和19g/mL的微生物菌群。结果表明，从盐浓度较低（5g/100ml）的盐芽中，经DNA提取、套式PCR、DGGE电泳和克隆测序，分离出4条明显的亮带。这些条带被鉴定为西巴里亚魏氏菌、乳球菌属、魏氏菌属、乳酸乳球菌和盐浓度高的盐芽（19g/100ml）。从竹笋中分离出5条明显的亮带，分别为绿气球菌、赖氨酸杆菌、未培养细菌、厌氧杆菌和芽孢杆菌，低盐腌渍的优势菌为益生菌，高盐腌渍的优势菌为益生菌。具有很强抵抗力的细菌。基于16S DNA的PCR-DGGE技術为分析竹笋的微生物多样性提供了一种可靠、快速、有效的方法。

2.2 食品微生物动态监测

在同一个时间段内，研究对不同的实验对象，可以使用DGGE技术，它对食品生产、储存、发酵的过程中，各种微生物种群的变化，都进行了严格的检测。对食品中微生物种群的变化，能够在第一时间内，精准的检测出来，对食品在工业化生产、贮藏环境的设置等方面，提供了很大的便利，也保障了食品的安全质量。所以，在对微生物种群的研究中，DGGE技术起着至关重要的作用。

冉甘桥、张红岩、任平认为，经自然积累发酵预处理后，葛根总异黄酮的提取率提高了5.7%。然后，采用传统平板法和PCR-DGGE技术对发酵过程中不同阶段微生物区系的变化进行了分析，筛选出在发酵过程中起主要作用的微生物。结果表明，自然发酵过程中细菌数量呈上升-下降-再上升的趋势，温升期明显增加，高温期减少，冷却期再次增加，整个发酵过程中真菌数量继续增加。

任方方，赵笑，赵凯介绍了，变性梯度凝胶电泳技术的概念，以及研究动物微生物种群的作用，都进行了总结，并且，对此技术的应用前景进行了展望。

2.3 食品微生物快速鉴定

DGGE技术在提取微生物总核酸时，是从实验对象中进行的，而不是使用以前的培养方式。经聚合酶链反应（PCR）扩增后，用DGGE获得条带，并进一步采用种或群特异性。在相同条件下，通过性探针与所获得的条带的杂交、条带切割和再现后的测序，或者是与对照微生物，其DGGE电泳的数据，来直接进行对比，可以在短时间内，判断出实验对象中新生的微生物。

DGGE技术不依赖传统的培养方法，直接从食品样品中提取微生物总核酸。经聚合酶链反应（PCR）扩增后，用DGGE获得条带，并进一步采用种或群特异性。在相同条件下，通过性探针与所获得的条带的杂交、条带切割和再现后的测序，或者是与对照微生物，其DGGE电泳的数据，来直接进行对比，可以在短时间内，判断出实验对象中新生的微生物。

3 结语

在研究食品微生物的领域，DGGE技术的发展前景非常好。使用这个技术，可以在最短的时间内，对食品成熟时微生物群落的演替进行测试，而且能有效地评价食品原料、中间产品和最终产品的质量，对食物在生产时，能够进行严格的把关。并且，这个技术发展潜力也是无限的，比如：在食品的出处、食品是否有微生物污染、其生长的地理环境等。保障了食品的安全质量。

参考文献

[1] 郑炯，夏雪娟，叶秀娟，et al.PCR-DGGE技术分析腌制麻竹笋中微生物多样性[J].食品科学，2014，35（21）：170-174.

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