膜耦联蛋白分子junctophilin的研究进展

郑春光

摘 要：细胞内的Ca2+转运是通过特定的钙离子释放（例如ryanodine和IP3受体）通道所维持的，而且细胞内的Ca2+转运能直接调控包括肌肉收缩、内分泌以及神经系统的兴奋性等重要的细胞内反应。细胞内肌浆网作为钙库即参与了Ca2+摄取，储存和释放的过程，又参与细胞膜与胞浆内蛋白之间的协同合作。最近研究发现Junctophilin（JPH）是参与形成膜耦联复合体（JMC）的重要蛋白分子。其主要功能是在JMC中使细胞膜和肌质网保持一个较固定的距离， 为细胞膜与肌质网之间的信号转导提供结构基础。而且大量的基因敲除实验证明了junctophilin蛋白分子是维持小鼠肌细胞内ryanodine受体介导的钙释放所必需的。并且通过对心肌细胞钙释放的研究，特别是缺乏junctophilin蛋白分子的心肌细胞突变体，在T管（T-tubule）发育、心力衰竭、心肌病、心律失常的发生发展中起着特别重要的作用[1]。本文主要归纳了junctophilin蛋白分子从发现到临床研究的进展过程，在此基础上，对其进一步的研究方向进行展望。

关键词：junctophilin;膜耦联复合体;钙释放;心脏疾病

中图分类号：R541 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）03-0175-02

1 Junctophilin基因家族

研究发现JPH在动物界的表达是高度保守的。通过对比不同物种JPH蛋白序列发现了JPH家族的进化来源，而且JPH分子的进化的细节也逐渐被发现。其中在对41个物种（27种无脊椎动物和14种脊椎动物）的进化分析中发现了64个全长的无重复的异构体。这其中有19种哺乳动物的JPH序列和45种非哺乳动物序列。JPH蛋白全长序列大约在600到900个氨基酸之间。只有5个序列少于560个氨基酸，这些较短序列的异构体在3′末端含有不完整的序列，但是在N末端的MORN区和链接区仍存在重要的保守序列。

1.1 JPH的序列

通过对JPH蛋白家族的识别，其大体结构已经被了解到是由8个在N末端区域的MORN序列，一个α螺旋和一个C末端的跨膜序列共同构成的。通过整个的氨基酸序列分析对比发现JPH异构体在整个进化过程中都是高度保守的。甚至已经在第一组MORN基序（（I-VI）和第二组MORN基序（VII-VIII），α螺旋样区以及跨膜区发现了进化中的高度保守区。

在人类的JPH异构体（JPH1-4）中，氨基酸序列的保守区约占整个序列长度的42%到59%。而α螺旋区域的保守片段的比例约在40%到68%之间。在六种哺乳动物的JPH2亚型中，氨基酸的保守序列占整个蛋白的73%。这些高度的保守区域证明了这些区域在JPH蛋白分子中起着特殊的作用。这些区域的突变可能会使蛋白的结构和功能产生变化从而影响蛋白的正常作用。

1.2 MORN功能区

JPHs基因包含了多个重复的MORN基序。有研究证明MORN基序表达后的结构可能作用于细胞膜上的蛋白质。在JPHs中MORN基序高度保守，在整个种属中其氨基酸同源性大约在76%（MORN II）到90%（MORN I）的范围内。当对在MORN基序中包含的十四个氨基酸的个别氨基酸的保守性进行分析时，研究发现在整个JPH异构体中大多数的变异是由第六个和第七个氨基酸决定的。大多数氨基酸的保守度大约在80到100%之间，然而这两个氨基酸位置的保守度平均在51到52%之间。有趣的是，在果蝇变异体的MORN IV基序中发现了在第六个和第七个氨基酸的位置之间多了一个赖氨酸，而在大乳头水螅变异体中多了一个天冬氨酸。

MORN基序被认为是结合到细胞膜的关键功能区域，所以这些序列被认为是决定JPH结合位点表达的关键序列。目前发现人类体内的JPH异构体基因突变后能引起某些严重的心脏疾病。特别是在MORN基序发生基因突变时，能够改变JPH2的膜结合能力，从而影响JHP蛋白分子在心脏中的功能，导致心肌病的发生[2]。

1.3 连接区

连接区的序列位置存在于第一组的MORN序列（I-VI）和第二组的MORN序列（VII-VIII）中。现在已经证明了连接区基因序列表达后存在高度保守性。为了对比不同异构体JPH1-4连接区保守型氨基酸的差异，有研究将这四种亚型的JPH序列进行排列对比。通过对人、褐家鼠与小家鼠的连接区序列排列对比后，研究发现了在神经细胞表达的JPH高度的保守，其中JPH3的连接区域有99.3%保守度（在这三个种群里144个氨基酸仅有一个不同），而JPH4高达98.7%的保守度（139个氨基酸有两个不同）。而在骨骼肌中的JPH1和心肌中的JPH2连接区域的保守區域稍微有点低分别为97.0和87.3%。连接区的高度保守表达表明了该区域在JPH的功能中起到了重要的作用，可能在调节JPH与脂膜的结合中起重要的作用。

1.4 α螺旋结构域

α螺旋结构域位于JPH蛋白的中间区域，由大约100氨基酸组成。α螺旋结构域被认为是连接细胞膜和内质网膜之间的桥梁。这一区域在不同异构体的保守度非常低，大约在40%到68%之间。在电镜观察中发现心肌细胞的细胞膜和内质网膜之间的间隙大约是12nm。然而当JPH2缺失时心肌细胞内这个间隙会明显变小，这种调节可能与α螺旋结构域的作用有关。

1.5 可变区

尽管可变区在整个物种的基因进化中有重要意义，但它的具体功能还并不清楚。通过比较不同异构体（JPH1-4）可变区的基因表达，发现其存在较低的保守性，其中人类，小鼠和大鼠分别为17.2%，15.5%和17.5%。在同种属内的不同异构体之间的特异性表明了可变区可能在JPH特异性功能中起到了重要的作用。有一种假设是可变区介导了JCM复合物中蛋白质之间的特异性相互作用。

2 JPs的亚型及分布

细胞膜和肌质网（SR）之间的耦联复合体是兴奋性细胞的共有特征，而且耦联复合体介导了细胞表面和细胞内离子通道的相互作用。现在研究已经发现JPs是一种属于耦联复合体的新型的保守型蛋白家族。目前在在小鼠体内发现了至少有四种JPs亚型：JP-1，-2，和-3，-4。研究发现在mRNA和蛋白表达水平上，小鼠体内JP-1的mRNA主要分布在骨骼肌组织中， 心脏和脑中也有少量分布，而蛋白表达主要分布在骨骼肌中。并且JP-1和JP-2在骨骼肌细胞中共定位于三联体结构处。而JP-3和JP-4的mRNA及蛋白表达则均存在于脑中。JP-2主要在心肌细胞内大量表达，目前研究发现缺乏JP-2的变异小鼠会因为心功能衰竭而死于胚胎期。目前还有研究者发现在窦性心律失常与慢性房颤的患者中JP-2的表达明显下调[3]。

3 JPs的結构与功能

哺乳动物的JP亚型是由628个氨基酸残基构成，在JP的N末端是由14个氨基酸组成的MORN区域，在羟基末端有一个跨膜片段连接内质网膜。含有MORN基序的氨基末端能特异性的与细胞膜产生相互作用，可能是由于其与磷脂之间有很大的亲和力。而且通过两栖类动物胚胎表达系统发现细胞膜与肌质网的相互作用可以使JP高效的产生JCMs。哺乳动物的基因组中含有四种特异性的JP亚型基因。现在已经成功的培养出敲除JPs亚型的小鼠，实验证明了JPs是骨骼肌细胞中钙离子通道和RyR2之间生理功能耦联的关键蛋白分子，并且在心肌的兴奋收缩耦联中是必不可少的。而且神经元中的JPs能介导RyRs通道的功能交联，从而在海马以及小脑的神经元中产生后超极化。与哺乳动物的JP亚型相比较，无脊椎动物只有一个JP基因，而且这一个基因亚型对肌肉的兴奋收缩耦联有很重要的作用。

电镜观察发现在兴奋性细胞中，细胞膜和内质网膜之间的膜耦联复合物（JMCs）有几种不同的类型：在骨骼肌中的是“三联体”;在心肌中是内质网膜与心肌细胞T-管形成的“二联体”;在平滑肌和不成熟的横纹肌中形成简单的“外围耦联”，而且在神经元内也存在相似的超微结构特征。在骨骼肌细胞三联体的组成研究中，JPs被认为是参与形成JCMs最有可能的蛋白分子。有研究认为JPH与细胞膜之间的相互作用是蛋白分子与胞膜脂质的直接作用。但是一些研究却得出不相同的结论，有研究者通过免疫共沉淀实验发现位于caveolae区的JPH2与细胞膜的相互作用是通过cav-3蛋白介导的[4]。还有研究进一步发现经过JPH1敲除的小白鼠大腿、舌等多个部位的肌肉细胞内三联体结构数量明显的降低。这表明了JPH1可能与肌细胞内三联体的形成或维持有关。在相应的心肌细胞研究中也发现了类似的情况，这更加证明了耦联体与JPHs之间的作用密不可分。

4 JPs与疾病

最近研究发现JPs亚型和人类的疾病有着明显的关联。JP2的表达水平在心肌肥厚、心力衰竭、心房颤动等心脏疾病中出现明显异常[5]。通过膜片钳技术、共聚焦显微镜与钙瞬变技术的结合发现JP2在心肌细胞钙促钙释放过程（CICR）中起着重要的作用。在患有心肌病的小鼠和人类中发现JP2蛋白分子的表达明显减少，JP2的表达降低直接影响到钙离子的稳定释放，这可能是成为心脏病变的基础。而且在人类的肥厚型心肌病患者中发现JP2基因有几个明显的错义突变。在这些病人中，JP2的突变可能慢慢的会导致钙离子信号的减弱，从而引起基因表达改变导致心肌肥厚。另一方面，神经中枢中的JP3基因突变可引起与亨廷顿氏舞蹈病相似的表型病变。尽管JP3和JP4在大脑的神经系统里可能作为一种辅助性蛋白共表达，但他们分布和表达的密度有轻微的不同。在敲除JP3的小鼠中发现，长期的JP3缺失能引起神经元膜电位的异常兴奋。而且JP3缺失引起的非正常性神经元兴奋会导致神经元逐渐退变。

综上所述JPH是维持细胞膜和内/肌质网膜之间信息交通所必不可少的。而且对JCM的形成起到了重要的作用。其分子表达和心脏疾病之间有着重要的联系。随着对JPHs的研究的深入，使人们对JPHs与其疾病的关系有了进一步的认识和理解，为临床上治疗疾病提供了新的思路和视点。

参考文献

[1] 张蓬，余跃，王世强.膜耦联的关键分子junctophilin[J].生理科学进展，2009，40（03）：209-213.

[2] 申华，李妙龄，何登科，殷亮，奚望，王志农.心肌JPH2蛋白的生理和病理生理功能研究进展[J].第二军医大学学报，2015，36（04）：429-433.

[3] 李妙龄，欧贤红，李涛，毛亮，杨艳，曾晓荣.慢性心房颤动降低Junctophilin-2在心房中的表达研究[J].重庆医学，2016，45（22）：3046-3048.

[4] Woo JS， Hwang JH， Ko JK， et al. Glutamate at position 227 of junctophilin-2 is involved in binding to TRPC3. Mol Cell Biochem，2009，328：25-32.

[5] 何容芳，李妙龄.Junctophilin 2功能异常与心脏疾病的研究进展[J].西南医科大学学报，2018，41（05）：457-461.