高灵敏度HBV DNA检测的临床应用及意义

王杰 于广鑫 鲁凤民

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性公共卫生问题。据世界卫生组织估计，全球约20 亿人感染过HBV，其中2.57 亿人为慢性HBV感染者，每年约有65 万人死于HBV 感染所致的肝硬化和肝细胞癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）等终末期肝病［1-2］。2016年，我国人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）流行率估计为6.1%，慢性HBV 感染者约8 600 万人，接近全球慢性HBV 感染的1/3。在这些慢性HBV 感染者中，约有2 000 多万例为慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者，约100 万例为肝硬化患者，30 万例为HCC 患者［3］。目前，临床上主要通过免疫学检测和HBV核酸（DNA）检测进行HBV 感染的诊断和抗病毒疗效的监测［4］。在我国，提出高灵敏度HBV-DNA检测试剂这一表述有其特殊性，主要是针对我国早期的HBV DNA 定量检测试剂灵敏度相对较低而言。相比于国内传统的HBV DNA 检测试剂，高灵敏度HBV DNA检测试剂具有更低的检测下限和更广的线性范围，且特异性好，能够缩短检测的窗口期，更高效地实现对HBV 感染的早期诊断，进而更好地实现早期干预治疗和阻断HBV 传播的目的。因此，高灵敏度HBV DNA 检测在OBI（Occult hepatitis B virus infection，OBI）筛查、术前检查、肿瘤患者放、化疗后HBV再激活风险评估、抗病毒治疗疗效与终点评价以及预测HBV 表面抗原（HBeAg）阴性患者HBV 耐药突变等方面表现出了突出的临床价值。

1 高灵敏度HBV DNA 检测与OBI 和术前HBV 筛查

1.1 OBI 与输血安全

1978年科学家首次发现HBsAg 阴性、核心抗体（抗-HBc）阳性的献血者血液可使受血者感染HBV，并提出了OBI 可能会导致HBV 传播的观点［5］。最初，诊断OBI 主要依赖于HBV 的血清学抗原、抗体标志物和HBV DNA 的检测［6-8］。随后，人们发现血清HBV DNA 的检测不足以完全判定OBI，而肝组织中HBV DNA 的检测可能是判定OBI 更可靠的方法［9-11］。2007年，Raimondo 等提出检测肝组织或血清中HBV DNA 的不同区域可提高OBI 检测的灵敏度和可靠性［12］。

2008年OBI 被首次定义为：排除HBV 感染窗口期，按照现有血清学检测技术检测血清HBsAg 阴性，无论血清中能否检测到HBV DNA，但肝组织中HBV DNA 阳性［13］。随着基因扩增技术的发展，巢式PCR、实时荧光定量RCR 和液滴数字PCR 先后被用于OBI 的实验室诊断，并通过对肝组织和血清HBV DNA 的多个区域进行特异性检测，以两个及以上区域检出阳性作为诊断OBI 的标准［13］。众所周知，由共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）转录产生的HBV 前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）经逆转录合成病毒DNA 负链，再经跳转后合成正链，形成不完全闭合的松弛环状双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）［14］。由于3.5 kb 长的pgRNA 只能来源于cccDNA，所以pgRNA 逆转录产生的rcDNA 也只能来源于cccDNA，rcDNA 的存在不仅间接反映了cccDNA 的存在，更提示其处于转录活跃状态。此外，rcDNA 也是cccDNA 的唯一来源。因此，cccDNA 和/或rcDNA 的存在均具有HBV 再激活和再感染的潜能。与之不同的是，整合至宿主基因组的HBV DNA 片段主要来源于病毒正链DNA 合成时错误跳转所形成的双链线性HBV DNA（double strands linear DNA，dslDNA），所以其不具有作为模板转录产生子代病毒的能力［15-16］。由于整合的HBV DNA 片段的断端主要集中在HBV 基因组的直接重复区（direct repeat，DR）1 和DR2 附近，这一特性使我们能够很好地将具有完整病毒复制潜能的cccDNA 和rcDNA 与整合的HBV DNA 片段区分开来。在排除了整合HBV DNA 的干扰之后，rcDNA 和/或cccDNA 检出阳性，即可被判定为OBI。在此基础上，我们建议OBI 应更加严谨地定义为：排除HBV 感染的窗口期，按照现有血清学检测技术检测HBsAg 阴性，血清HBV DNA 低于检测下限或低值阳性（＜200 IU/mL），但肝组织中HBV rcDNA 和/或cccDNA 阳性［17-18］。

OBI 发生的主要原因是由于肝组织内cccDNA很难被清除，大部分HBV 被宿主免疫清除后仍有少量病毒残留，导致HBV 低水平复制［19］。另外，免疫复合物的形成、S 基因变异以及合并其他肝炎病毒感染也是导致OBI 发生的原因［20］。OBI 的流行率与HBV 感染率呈正相关［21］。我国是乙型肝炎高发区，HBV 既往感染人数曾占全人群的50%以上，献血者中OBI 检出率约为0.03%～0.2%，也明显高于西方发达国家0.007%～0.05%的水平［22］。如何避免感染HBV 的供血者的血液造成输血后感染，是输血的各种风险中需要防范的重点之一。尽管随着血清学检测灵敏度的不断提高，通过HBsAg 的筛查排除了绝大多数HBV 感染者，使得输血造成HBV 感染的风险大大降低，但OBI 引起的输血后HBV 感染仍不能被有效排除。HBV 核酸检测（nucleic acid test，NAT）是避免输血后HBV 感染的筛查手段之一，我国于2015年12月将NAT 纳入血液常规检测［23］。目前，NAT 的灵敏度已有较大提高，检测下限已由之前的20 IU/mL 下降至3.4 IU/mL［24-25］。我国输血后HBV 感染的风险随着HBV DNA 检测灵敏度的提高日益下降，但输血后HBV 感染的问题依然存在。根据Locarnini 等的计算，NAT 的检测下限需要达到0.15 IU/mL 才能完全避免输血后HBV 感染［26］。由此可见，HBV DNA 检测的灵敏度仍需进一步提高。

1.2 术前HBV 筛查

HBV 是一类具有很高医源性感染风险的病毒，极少量含病毒的血液或血清就可导致该病毒的传播［27］。临床上进行手术、侵入性操作、血液透析以及医疗器械未经有效严格消毒等均会增加HBV 医源性感染的风险。因此，针对手术患者进行术前HBV 筛查是很有必要的。目前术前HBV 筛查手段主要有血清学检测技术和分子诊断技术两种，其中血清学检测标志物主要包括HBsAg、表面抗体（抗-HBs）、HBeAg、e 抗体（抗-HBe）和抗-HBc，即乙肝五项；主要检测方法有胶体金法、酶联免疫吸附试验、化学发光法和重组免疫印迹试验等；分子诊断技术主要指HBV DNA 的定量检测［28］。由于隐匿性感染、病毒感染后的窗口期以及部分患者存在病毒抗原突变等原因，使得血清学标志物的检查容易造成漏诊［28］。高灵敏度HBV DNA 检测试剂的最低检测限可达10～15 IU/mL，在检测灵敏度和特异性方面有较大优势，可更准确地诊断HBV 感染，并能够显著缩短检测的窗口期，故可更有效地规避HBV 医源性感染的风险［29］。

2 高灵敏度HBV DNA 检测对肿瘤患者放、化疗后HBV 再激活的风险评估

恶性肿瘤导致人口死亡约占全球总死亡人数的六分之一。2015年恶性肿瘤导致全球880万人死亡，预计新病例数量将在未来20年内增加约70%［30］。除手术和放疗外，化疗仍是最常见的治疗恶性肿瘤的方法。我国的乙肝疫苗接种始于1992年，现阶段既往HBV 感染单核心抗体阳性者（单抗-HBc 阳性）在我国中老年人群中仍占有较大的比例。随着预期寿命的不断延长和全球恶性肿瘤新病例的不断增加，化疗引起的HBV 再激活将是一个更加严重的公共卫生问题。

HBV DNA 从一定的水平或检测不到发展至显著增加的状态，即高于基线水平2 log 或新出现的HBV DNA 水平达到100 IU/mL 以上，被定义为HBV 再激活［31］。HBV 再激活的主要因素是宿主失去对HBV 复制的免疫控制。在化疗期间，当免疫系统被抑制时，HBV 复制显著增加，并引起肝细胞的广泛感染。化疗停止后，免疫功能恢复，感染HBV的肝细胞可触发强烈的免疫反应，并导致较为严重的肝损伤［32］。

预防HBV 再激活的重要措施是对高危人群进行早期识别，在病毒激活之前加以预防。研究表明，每月监测血清HBV DNA 的水平（最低检测下限为11 IU/mL）能够有效地预防既往感染过HBV 的B细胞非霍奇金淋巴瘤患者发生HBV 再激活［33］。美国临床肿瘤协会在2015年的“暂行临床意见”中指出，对于HBsAg 阴性/抗-HBc 阳性人群，应定期监测其血清HBV DNA 和ALT 水平，若发生HBV 再激活，应立即进行抗病毒治疗［34］。同样，我国的慢乙肝防治指南中也要求对于所有因其他疾病而接受放疗、化疗、免疫抑制剂治疗的患者，在治疗前都应常规筛查HBsAg、抗-HBc 和HBV DNA［2］。这说明，无论是HBV 再激活高危人群的早期筛查还是肿瘤患者放化疗后监测HBV 再激活的风险，高灵敏度HBV DNA 检测均具有重要的临床意义。

3 高灵敏度HBV DNA 检测评价抗病毒治疗的疗效与终点

目前，各国（地区）的慢乙肝防治指南根据高灵敏度检测试剂的检测能力对HBV DNA 检测下限进行了设定，并以此指导抗病毒疗效的评价以及抗病毒治疗终点建议的评估。亚太肝病研究学会（Asia Pacific association for the study of liver，APASL）2015年版慢乙肝防治指南中将HBV DNA＜12 IU/mL 设定为低于检测下限［35］；美国肝病研究学会（American Association for the study of liver disease，AASLD）2018年版慢乙肝防治指南中则分别对恩替卡韦、替诺福韦和替诺福韦艾拉酚胺（二代替诺福韦）完全病毒学应答时的HBV 检测下限进行了设定，分别为60 IU/mL、60 IU/mL 和29 IU/mL［36］；欧洲肝脏研究协会（European Association for the Study of the Liver，EASL）2017年版慢乙肝防治指南中将HBV DNA＜10 IU/mL 设定为抗病毒治疗的完全病毒学应答［37］；世界卫生组织（WHO）2015年版慢乙肝防治指南中则将检测下限设定为15 IU/mL［38］；我国2015年版慢乙肝防治指南中虽然没有明确给出HBV DNA 的检测下限，但仍规定非活动性HBV 携带者必须满足HBV DNA低于检测下限或＜200 IU/mL2。这说明，相对于国内传统的检测下限较高的HBV DNA 定量检测试剂而言，高灵敏度HBV DNA 检测可更好地评价慢乙肝抗病毒疗效以及评估抗病毒治疗的终点。

4 高灵敏度HBV DNA 检测预测HBeAg 阴性患者HBV 耐药突变

HBeAg 是反映HBV 复制和感染能力的一个重要指标，临床上常用HBV 复制抑制、ALT 水平恢复正常、HBeAg 血清学转换来评估慢乙肝患者抗病毒治疗的效果。但值得注意的是，HBeAg 阴性并不能完全代表HBV 处于复制抑制状态。虽然HBeAg 阴性慢乙肝患者中HBV 载量较低，但HBeAg 转阴可能是由于HBV 基因变异引起的，此时的病毒仍处于活跃复制状态，并更容易对抗病毒药物产生耐药［39］。此外，对于此部分HBV 耐药突变患者，传统的灵敏度较低的HBV DNA 检测无法为血清HBV DNA 是否真正转阴提供可靠参考。研究表明，对于HBeAg 阴性慢乙肝患者进行高灵敏度HBV DNA 检测，可更好地观察抗病毒疗效和优化抗病毒治疗方案［40］。由此可见，高灵敏度HBV DNA 检测能够更加有效地判断HBeAg 阴性患者的抗病毒疗效，并为HBV 耐药突变的预测及治疗方案的调整提供可靠参考。

5 总结

高灵敏度HBV DNA 检测以其检测下限低和线性范围广等优势，已逐步应用于慢乙肝的临床诊断和抗病毒疗效评价的各个环节中，并且更符合“精准医学、精准治疗”的要求。然而，高灵敏度HBV DNA 检测仍存在一些亟需解决的问题。首先，高灵敏度HBV DNA 检测的灵敏度仍有待进一步提高，如输血筛查理论上需要检测试剂的最低检测下限达到0.15 IU/mL 才能完全避免HBV 感染，这是现阶段难以企及的高度。其次，极高的检测灵敏度意味着检测结果更容易受核酸污染的影响，这要求更加严格的操作环境和更加规范的标准操作规程。此外，现阶段高灵敏度HBV DNA 检测的标准化管理尚不健全，这导致不同厂家、不同机构所生产和使用的仪器和试剂所表达的“高灵敏度”参差不齐，检验效能上存在较大差异。虽然现阶段高灵敏度HBV DNA 检测面临这些问题，但其在OBI 筛查、术前HBV 筛查、肿瘤患者放、化疗前HBV 筛查、评价慢乙肝患者抗病毒治疗的疗效与终点、以及预测HBeAg 阴性慢乙肝患者发生HBV耐药突变风险等方面具有难以替代的优势。相信未来随着科学技术的发展以及相关机构的逐步重视，高灵敏度HBV DNA 检测会更加快速地发展，并在临床上得到更加广泛的应用。