循环肿瘤细胞在结直肠癌临床诊疗中的应用

谢礼锋， 陈鸿源， 许 超(综述)， 薛芳沁(审校)

结直肠癌高发于发达国家和地区，但随着我国经济的发展和城市化的进程加快，居民饮食结构和生活习惯的改变，近年来，我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈上升趋势[1]。结直肠癌是造成全球疾病负担的第三大肿瘤，发病率仅次于肺癌和乳腺癌，严重威胁居民健康[2]。随着结直肠癌的诊断方法、手术技巧及治疗方案的不断优化，患者的预后得到一定程度的改善。手术切除是结直肠癌的主要治疗手段，但复发和转移是导致预后不良的重要因素[3]。研究表明，肿瘤的远处转移与血液中存在的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)形成的微转移密切相关[4]。1869年，Ashworth教授首先提出了CTC的概念，CTC是指自发或因诊疗操作由实体肿瘤或转移灶释放进入外周血循环的游离肿瘤细胞，进入循环后未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，最终发展为转移灶[5]。CTC具有与原发肿瘤病灶高度相同的肿瘤特异性抗原和基因学特征，具有极高的肿瘤特异性，可用于恶性肿瘤疾病的体外“液体活检”[6]。目前，依赖影像学和肿瘤标志物的检查，难以发现早期肿瘤的生长，而检测外周血中的CTC快捷无创，对于早期发现肿瘤、动态监测疗效和评估预后等都具有极高的临床应用价值。

1 CTC的富集和分析

1.1CTC的富集与分离 CTC在肿瘤患者的外周血中数量极少，每10 mL的血液中仅有几个至十几个[7]，需要先将外周血中的CTC进行分离和浓缩，以提高检测的灵敏度。目前，CTC的富集和分离主要是根据物理学和免疫学特征将其从外周血细胞中筛选出来。基于CTC的物理特性，例如细胞大小、密度和电学特性；基于抗原抗体特异性结合反应的免疫富集方法，包括正向富集和负向富集两种。

1.1.1基于CTC的物理学特性 研究表明，肿瘤细胞的直径为15～25 μm，而白细胞直径为8～14 μm，根据细胞直径的不同，利用具有一定大小的滤过膜可以将直径较大的CTC富集分离出来[8]。基于外周血的各种细胞密度差异产生不同的细胞沉降系数，红细胞、白细胞和肿瘤细胞的相对密度分别为1.092，1.065和1.056[9]。利用密度梯度离心法，将外周血中不同密度的细胞组分进行分离。Rosenberg等运用此法对CTC进行富集，发现结直肠癌患者外周血的CTC阳性率为41%[10]。该方法对设备的要求不高，操作较为简单，但易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。不同细胞具有不同的电学特性，在电场中，这些细胞产生的电偶极距大小和方向存在差异，利用其受到的力学作用不同，将目的细胞分离出来。利用电学原理在血液中捕获肿瘤细胞的效率可达70%[11]。基于细胞物理学特性富集的CTC细胞形态保存完整，细胞表面的各种抗原或分子均未被破坏，简单且易于操作，但灵敏度较低。

1.1.2基于CTC的免疫学特性 外周血肿瘤细胞免疫富集的方法是基于抗原抗体特异性结合的原理，分为正向富集和负向富集两类。正向富集是针对CTC表面表达的特异性肿瘤细胞抗原，如EpCAM，利用带有标记的外源性EpCAM抗体与之结合，从而达到CTC的直接捕获和富集。近年比较常用的Cell Search系统就是基于免疫磁珠法进行正向富集，也是目前唯一一个获得FDA批准上市的产品。此外，还有磁珠分选系统MACS(Miltenyi Biotec Gmb H)和Mag Sweeper系统[12-13]，其CTC的富集特异度大大提高。在提高检出特异度的同时，为了避免检出敏感度的下降，Adna Test采用了含多种抗体的免疫磁珠对CTC进行分选。反之，负向富集的的靶点则是白细胞表面的抗原，例如CD45，利用外源性CD45抗体结合白细胞后，将白细胞筛除，从而达到去除背景血细胞而富集CTC的效果。Easy Sep®系统(Stem Cell)就是采用CD45免疫磁珠对外周血肿瘤细胞进行富集，其阳性率约64%[14]。负向富集的方法不依赖CTC表面特异性抗原，具有通用性，适用于各种肿瘤细胞样本，但其富集纯度较低。近年，基于微流体芯片的免疫吸附法也开始应用于科研和临床[15]，其原理类似于免疫磁珠法，微柱状阵列结构表面上包被的EpCAM抗体与流过的外周血中CTC相结合，达到截留富集目的。

1.2CTC的检测与分析 CTC的检测分析方法分两大类：细胞计数法和核酸检测法。前者主要包括免疫细胞化学法和流式细胞术等，后者主要包括聚合酶链式反应和逆转录聚合酶链式反应等。免疫细胞化学法以显色剂标记的特异性抗体进行细胞原位抗原抗体反应和化学呈色反应，对相应肿瘤抗原可进行定性、定位和定量测定，但敏感性不高。流式细胞术是一项集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体的新型技术，定量计数肿瘤细胞，数据精确，还可对细胞进行多参数分析，但价格昂贵、耗时较长，限制了该技术在临床中的广泛应用[16]。PCR技术检测肿瘤患者外周血中的CTC是通过检测血细胞中癌基因和抑癌基因的异常表达，该方法敏感性虽高，但假阳性率也较高，适用范围有限。RT-PCR技术是在PCR技术的基础上发展而来，扩增由血细胞中表达的肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段，从而分析肿瘤特异性mRNA的表达水平。这些肿瘤特异性mRNA不表达于正常外周血细胞，且半衰期较短，在细胞裂解后会迅速被RNA酶降解，有较高的敏感性和特异性。在外周血中检测到肿瘤特异性mRNA可以间接提示CTC的存在，肿瘤特异性mRNA水平可以间接反应CTC水平[17]。RT-PCR及其各种改进的技术可以对肿瘤特异性mRNA进行相对定量，甚至绝对定量，目前在CTC的检测中应用最为广泛，被认为是目前检测CTC最有效的方法之一。

2 影响血液CTC水平的因素

2.1肿瘤疾病本身 CTC从实体瘤中脱落入血，其在血液中的数量与原发灶的性质、进展程度及机体的免疫状态密切相关。CTC在血液中的水平与肿瘤的临床分期、分化程度、浸润深度、脉管侵犯、淋巴结转移、远处转移及复发均密切相关。Sastre等使用Cell Search系统检测了94例结直肠癌患者的外周血CTC，发现CTC的阳性率为36.2%，且与结直肠癌的临床分期相关(Ⅱ期20.7%，Ⅲ期24.1%，Ⅳ期60.7%)[18]。在无远处转移的结直肠癌患者中，其CTC数量随着肿瘤的T分级、N分级、肿瘤大小、分化程度的恶性度升高而上升[19]。Akiyoshi等认为，CTC的数量也与肿瘤细胞的侵袭性显著相关，经病理证实，中低分化的肿瘤细胞较高分化者，外周血更易检出CTC[20]。此外，CTC存在于外周血中，要克服血流的剪切力、免疫系统、细胞因子及低氧等各种血液微环境的影响，其数量随着由瘤灶脱落后的时间延长而减少[21]。反之，从外周血中检测CTC的水平亦可反映肿瘤病灶的恶性程度、治疗效果以及肿瘤的复发转移。传统评估肿瘤的恶性度，需先进行手术切除肿瘤病灶，且进行病理检测，并根据病理结果进行临床分期、选择化疗方案和评估预后，具有一定的盲目性。在临床诊疗过程中，术前主要通过影像学检测评估肿瘤是否发生远处转移，而部分患者发生远处微转移是影像学检测不到的，这时通过检测CTC进行评估可能是一个不错的选择。

2.2取样部位 结直肠癌患者CTC的检出率和表达水平与血样采集血管的部位相关，肿瘤灶引流静脉血和外周静脉血往往存在一定差异。肿瘤病灶脱落入血的游离肿瘤细胞首先进入引流静脉(肠系膜静脉)，再经过门脉系统进入肝脏，最后汇入外周循环。因肝脏的过滤作用造成外周血中CTC水平比引流静脉低。Rahbari等利用Cell Search系统检测了200例结直肠癌患者肠系膜静脉和外周静脉中的CTC水平，发现Ⅱ及Ⅲ期结肠癌和中上段直肠癌的肠系膜静脉血CTC的检出率较外周静脉更高[22]。门静脉或肠系膜静脉血中CTC水平较外周静脉血高，预示着发生肝转移风险性明显增高[23]。肿瘤细胞由引流静脉播散至远处脏器，早期肿瘤患者外周静脉血液中肿瘤细胞数量极少，临床和科研中常从引流静脉取血进行CTC检测。

2.3手术操作 手术操作过程中，肿瘤组织受到挤压、牵拉，易导致肿瘤细胞脱落入血，造成肿瘤播散的风险。Lelievre等通过动物实验对比了腹腔镜与开腹两种术式对CTC的影响，发现术前及术后CTC的检测率并未上升，且各手术组间并无差别，首次通过CTC对不同手术方式的肿瘤学效应进行了比较[24]。Park等通过对42例结肠癌患者的手术进程中的不同时间点，肠系膜下静脉和外周血CEA mRNA和CK20 mRNA的水平进行检测分析，发现其在术前外周静脉血和肠系膜下静脉血中的阳性率无显著差别；调整肿瘤肠段后，其检出率有升高趋势，手术后较术前检出率显著升高，但不同手术方式间并无显著性差异；认为无瘤操作技术是影响CTC入血数量的主要因素，而非手术方式[25]。Jussf等研究发现，术中采血是提高CTC捕获效率的一个有效途径[26]。手术使用的器械对肿瘤细胞入血也有一定影响，如超声刀可使切开的组织及时凝固、血管闭合，降低癌细胞播散的机会[27]。“无瘤原则”是肿瘤根治术的基本原则，术中严格遵守无瘤原则，对减少肿瘤医源性扩散及术后复发转移、提高远期疗效有重要意义。

2.4检测技术和方法 结直肠癌患者的CTC检出率及表达水平与游离肿瘤细胞的富集和检测技术密切相关。有效的检测方法要求外周血富集后，能有效地区分外周血细胞和肿瘤细胞。至今为止，已开发超过40种检测技术，且不断有新的方法和技术出现，其敏感度和特异度各异[28-29]。Cell Search系统是基于免疫学原理最具代表性的CTC检测技术，在上皮表型阴性的样本中存在不同比例的CTC漏检，例如EMT标志物在CK阴性和阳性的CTC中的阳性率分别为38%和28%，意味着如果仅用上皮性抗原作为CTC富集的标志，将会有三分之一以上的CTC被漏检[30]。基于CTC的物理特性，不依赖细胞表面标志的检测技术较好地克服了上述缺陷，如微流控芯片技术和微过滤技术[31]。Farace等用基于上皮肿瘤细胞体积的分离技术(ISET)检测肿瘤患者外周血CTC，结果阳性率为95%[32]，而Cell Search系统的检测阳性率仅为70%。Li等应用Cell search系统和ISET技术对61例食管鳞状细胞癌患者进行检测和对比，发现ISET方法检出CTC 20例(32.8%)，而Cell Search系统检出1例(1.6%)，两者差别较大[33]。为了避免仅用单一方法检测CTC出现的种种弊端，近年来应用多种方法联合检测也屡见不鲜。

3 CTC检测的临床应用

外周血CTC水平可以反映肿瘤患者循环中游离肿瘤细胞的负荷，其水平的变化可作为治疗反应的一个敏感指标。恶性肿瘤疾病患者远处器官微转移与外周血中存在的CTC密切相关。CTC具有与肿瘤病灶高度相似的肿瘤特异性抗原或基因特征，从外周血中即可获得，对CTC基因进行检测可以间接反映肿瘤原发灶的生物学特征。CTC在肿瘤疾病的临床诊断、治疗指导及复发转移监测中具有重要的临床应用前景。

3.1CTC与肿瘤疾病诊断 CTC具有与原发肿瘤病灶高度相同的肿瘤特异性抗原和基因学特征，具有极高的肿瘤特异性。CTC“液态活检”相对无创，对结直肠癌的诊断具有一定临床价值。Wensy等报道，在620例门诊患者中，肠镜下诊断为腺瘤性息肉或早期至晚期结直肠癌438例，进一步行CTC检测发现，111例(25%)为癌前病变，327例(75%)为结直肠癌，即CTC检出癌前病变的灵敏度为76.6%、特异度为97.3%；检出结直肠癌的灵敏度为86.9%、特异度为97.3%；检出癌前病变和结直肠癌的准确率达88.0%[34]。提示CTC检测有利于早期发现结直肠癌。另有研究表明，在非转移性结直肠癌患者中，检测到的CTC平均数量随着肿瘤的T分期、N分期、肿瘤大小及分化程度的恶性度的升高而增加，而与患者的性别、年龄、CEA水平及大体类型无关[35]。CTC在早期肿瘤患者外周血中的数量极少，需经有效的方法富集和分离后才可检出，在早期肿瘤的临床诊断应用上具有一定局限性。

3.2CTC用于指导治疗 结直肠癌术后辅助化疗或者姑息化疗的目的是清除残留在循环中的游离肿瘤细胞以及微转移灶，其基因学特性与手术切除的原发灶高度相似，但亦可能存在细微变异。直接检测循环中CTC细胞的基因学特性或表观遗传学特征，可更直接指导辅助化疗用药。Musella等研究提示，通过CTC的基因检测，可在接受治疗前预测出抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)治疗的疗效，从而决定是否进行抗EGFR治疗[36]。结直肠癌治疗过程的一个重要挑战就是如何选择安全、可靠、及时的疗效评估手段以验证治疗方法的有效性，或对效果不佳的治疗方案进行调整，对CTC的监测在这方面具有重要的应用价值。Zhang等发现，CTC的持续阳性是接受化疗的晚期结直肠癌患者无进展生存期和总体生存率的独立危险因素[37]。对进展期和转移性结直肠癌患者，化疗和靶向治疗的主要挑战是肿瘤基因组的不稳定性和治疗诱导性耐药，故需开展连续动态活组织检查，才能精准指导制订治疗决策[38]。在耐药性方面，Abdallah等研究表明，通过CTC的胸苷酸合成酶的检测，可预测出对5-氟尿嘧啶抵抗的患者[39]。转移性结直肠癌患者检测CTC更有意义，CTC的分子特征，尤其在细胞粘附、EMT方面比原发灶肿瘤细胞更能提示远处转移的迹象[40]。

3.3CTC用于复发转移的监测 结直肠癌患者根治术后出现复发和转移归因于肿瘤细胞的传播，此风险目前不能完全通过TNM分期系统进行评估。复发和远处转移是结直肠癌患者根治术后的主要死亡原因。Lu等证实，CTC持续阳性是Ⅱ～Ⅲ期结直肠癌患者复发及预后不良的危险信号[41]。Bork的研究也证实，CTC阳性是结直肠癌复发转移的独立预后危险因素[42]。然而，到底是术前还是术后的CTC数量提供更可靠的预后信息，目前并不明确。Aggarwal等发现，治疗前CTC水平较低的患者(<3个，n=99)比较高的患者(≥3个，n=58)有更长的生存时间(20.8月vs11.7月)，且所有患者治疗前血液中CEA均为阳性，可见CTC可提供更多预后信息[43]。当前，迫切需要寻找一个理想的能早期准确地评估胃肠肿瘤患者发生复发或转移的指标，以使结直肠肿瘤的诊疗更加规范。

此外，CTC的体内或体外研究有助于开发新型抗癌药物，研究药物抵抗的作用机制，指导临床用药[44]。从分子学水平无创地对结直肠癌病情进行分析和诊治，避免了传统诊治方法的弊端(需先手术切除病变组织进行病理检测后再决定下一步诊治方案)，能实现体外肿瘤基因分析，精准选择治疗方案，是人类未来肿瘤疾病治疗的总体趋势。

4 展 望

大量研究证实，CTC与肿瘤复发和转移密切相关，检测CTC有助于肿瘤转移的早期诊断、临床分期、疗效监测及预后判断，并为肿瘤患者的个体化治疗提供有价值的临床指导。CTC作为结直肠癌独立的预后因素，可反映循环肿瘤负荷及肿瘤的生物学特性。有关结直肠癌CTC的研究还在不断地深入，但问题依然存在[45]：(1)缺乏理想的CTC分子标志和阳性计数标准；(2)如何分析其异质性；(3)CTC在循环中存活及其基因型和表观遗传特性发挥作用的机制；(4)CTC体外培养技术难度高，传代后基因型和表观遗传学。随着高通量测序以及单细胞基因组扩增技术的优化，CTC的未来朝着单细胞组学发展，摆脱了肿瘤组织标本的限制，使非创伤性诊断、监测成为了可能，为结直肠癌的诊断、治疗监测、预后评估等提供了简便途径。这也将有助于临床医师更深入地了解肿瘤转移的生物学特性，动态实时地分析患者的肿瘤分子特征，为真正的个体化治疗提供有价值的依据。