烟草及烟用香精香料中氨基酸检测方法研究进展

张萌萌，杨 芳

(陕西中烟工业有限责任公司 技术中心，陕西 宝鸡 721000)

烟草中的含氮化合物对卷烟评吸质量和消费者的健康有重要影响，因此受到研究者的普遍关注. 而氨基酸作为一类重要的含氮化合物，其含量与烟草品质有着密切的关系，直接影响着烟草吸味和烟气的丰满度. 游离氨基酸一方面与还原糖之间发生酶促以及非酶促棕色化反应，生成具有多种香味特征的吡嗪、吡喃、吡咯等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸自身还会分解，生成具有香味物质的化合物，如苯甲醇、苯乙醇等. 适量氨基酸有助于提高烟气劲头和增加丰满度，若过量则会产生刺激性，对卷烟吸味产生不良影响[1-4]. 因此，准确定量烟草和烟用香精香料中的氨基酸对卷烟配方设计优化具有重要的意义.

1958年，Spackman D H, Moore S等[5]发现了氨基酸自动分析的方法. 随着气相色谱、液相色谱以及检测器技术的发展，氨基酸的检测方法也得到了完善和拓宽. 根据是否衍生，氨基酸分析方法可以分为直接检测法和间接检测法. 间接检测法根据衍生的时机不同，可分为柱前衍生法和柱后衍生法. 本文旨在对比不同方法的优劣势，以期为烟草以及其他行业进行氨基酸分析的研究者提供参考.

1 直接检测法

1.1 高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法

高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法无需衍生、操作简便、灵敏度高，对氨基酸的检出限可达到pmol或fmol. 但是由于该方法能够检测羟基，因此能够检测糖. 烟叶中含有大量的糖类，这些物质会干扰烟叶中氨基酸的定量分析，因此必须除去. 潘媛媛等[6]采用自填装的DVB强酸性阳离子交换树脂柱离线去除了烟叶和烟草料液中的糖类化合物，以AminoPac PA10阴离子交换柱，NaOH和NaAc的强碱性溶液为淋洗液，积分脉冲安培法对氨基酸进行检测，回收率达76%～105%. 于宏晓等[7]先用商品化的SCX固相萃取小柱离线去除烟叶中糖类和色素，然后用离子色谱-积分脉冲安培法同时测定了烟草中18中游离氨基酸的含量，平均回收率80%～115%，最低检出限0.03～0.75 μg/mL,线性相关系数0.990 0～0.999 2.

1.2 高效液相色谱-串联质谱法

高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)具有灵敏度高、选择性好的优点，无需对样品进行衍生化和固相萃取等复杂前处理，大大提高了分析效率. 同时，串联质谱还具有特征离子提取功能，对待测物质的色谱分离度要求较低[8].

张婕等[9]采用LC-MS/MS建立了同时测定烟草中16种氨基酸和6种Amadori化合物的快速分析方法，方法简便快速，灵敏度高，特异性强. 马戎等[10]建立了LC-MS/MS测定烟草中20种游离氨基酸的方法，样品超声萃取并离心后直接进样测定，方便快捷，20种氨基酸的检出限为0.001～0.01 μg/mL，回收率86.4%～105.9%. 邓其馨等[11]利用LC-MS/MS的方法测定了烟用香精香料中的18种氨基酸，该方法分析速度快，灵敏度和准确性高，重复性好.

1.3 高效液相色谱-蒸发光散射检测法

蒸发光散射检测器作为一种通用型检测器，能建检测任何挥发性低于流动相的物质，是紫外检测器的有效补充，广泛的应用于化学、食品、药品等行业. 利用高效液相-蒸发光散射检测器检测氨基酸，具有检测时间短、灵敏度高的优点.

白玉静等[12]建立了用高效液相-蒸发光散射检测器测定清开灵注射液中氨基酸含量的方法，此方法对清开灵注射液中的19种氨基酸进行了含量测定，增加了清开灵注射液的质量控制指标. 鄢丹等[13]建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测器法同时测定中药阿胶中17种氨基酸含量的方法，在优化的条件下，在25 min内即可完成对阿胶中17种氨基酸的分离鉴定.

1.4 傅里叶变换近红外光谱法

傅里叶变换近红外光谱(FT-NIR)技术因其快速、非破坏性及多组分同时定量分析等优势，近年来已成功应用于烟草、食品、药品、化工等诸多领域产品的分析测定. FT-NIR用于氨基酸测定的不足之处在于低质量分数的氨基酸对NIR光谱信号反应程度较弱，建模效果不理想[14-17].

荆磊磊等[14]采用偏最小二乘法为建模方法，建立了烟草中组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以及游离氨基酸总量的近红外预测模型. 结论表明，样品的预测值和实际值间的相关性良好，而且，在显著性水平0.05时，NIR光谱分析法测得值与标准方法不存在显著性差异，表明所建模型准确可靠. 柯艺萍[15]也使用偏最小二乘法为建模方法，采用二阶导数和Norris滤波法进行光谱预处理，建立了烟叶中氨基酸含量的预测模型，与常规标准检测方法相比，结果表明，可以较为准确的测定烟叶中氨基酸的含量.

1.5 毛细管电泳-紫外检测法

常用的毛细管电泳-紫外检测法是选取合适的缓冲溶液，使样品溶液形成稳定的电渗流体系. 通过控制缓冲溶液的pH来实现氨基酸的分离，常用的缓冲溶液体系是磷酸盐和硼砂.

周贤婧等[18]考察了磷酸浓度、进样方式和缓冲液pH对分离效率和重现性的影响. 在分离电压为-15 kV、检测波长为220 nm条件下，以含有0.5 mmol /L十六烷基三甲基溴化铵、20 mmol /L烟酸、10%甲醇的10 mmol /L磷酸二氢钠缓冲溶液( pH 10.2)为运行缓冲液，9种组分在11 min内达到基线分离,检出限最低可达到0.3 mg /L. Chen等[19]研究了水杨酸盐、苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐和偏苯三甲酸盐作为背景电解质，结果表明苯甲酸盐的响应最为灵敏. 在pH为11.20，紫外光225 nm，缓冲溶液选择10 mmol的苯甲酸和1 mmol阳离子表面活性剂肉豆蔻酰三甲基溴化铵(MTAB)，可以分离17种氨基酸的混合物，检测限为10～50 μmol. 童萍[20]建立了一种简单快速测定不同产地太子参药材中9种氨基酸的毛细管电泳-间接紫外检测方法，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节14 mmol/L的对氨基苯磺酸至pH为11.2作为运行缓冲液，在分离电压20 KV时，9组分在12 min内实现了完全分离.

2 间接检测法

2.1 柱前衍生法

2.1.1 气相色谱法

气相色谱法分析氨基酸具有分析速度快、灵敏度高等特点，但是需要提前对氨基酸进行衍生化，常用的衍生化试剂有邻苯二甲醛、异硫氰酸苯酯、氯甲酸芴甲酯、2,4-二硝基氟苯、N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺等，每种衍生化试剂都有其适用性和局限.

刘百战等[2]基于氯甲酸乙酯衍生化，建立了一种用于烟草中游离氨基酸测定的毛细管气相色谱法. 该方法简单，衍生化可在水溶液中进行且速度快，所生产的衍生物较稳定，重现性和回收率均令人满意. 黄志等[4]采用对氨基酸进行硅烷化，然后在选择离子监测模式下进行GC/MS分析，内标法定量. 结果表明，18种氨基酸的定量标准曲线线性良好，方法的加标回收率为97.4%～114.1%，相对标准偏差为0.17%～3.4%.

2.1.2 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法用于氨基酸的测定灵敏、快速并且仪器能够一机多用，但是同气相色谱法一样，需要对氨基酸进行柱前衍生. 鉴于每种衍生化试剂都存在一些问题，因此有研究者尝试用两种衍生化试剂联合衍生.

景延秋等[21]用邻苯二甲醛/3-巯基丙酸作为衍生剂进行柱前衍生，建立了反相高效液相色谱测定白肋烟烟叶中游离氨基酸的方法，方法的回收率为95.3%～100.7%，RSD为2.32%～9.24%. 陈文等[22]用乙醇的水溶液提取烟叶中的游离氨基酸并通过阳离子交换柱纯化后，采用邻苯二甲醛丹酰氯(OPA)、9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC)联合在线衍生反相高效液相色谱法对烤烟、白肋烟和香料烟中的游离氨基酸进行了对比研究.

2.2 柱后衍生法

柱后衍生法是首先将样品通过色谱柱分离，然后用衍生试剂衍生化并检测. 衍生试剂常用的为茚三酮. 与柱前衍生相比，柱后衍生重复性好.

李娟等[23]采用酸水解法和氨基酸自动分析仪测定了8类天然食用香料浸膏中16种氨基酸的含量，结果表明，除了茉莉浸膏、酒花浸膏、爱普鸢尾浸膏中未检测到氨基酸外，其他浸膏都含有氨基酸，且种类基本相同，不同浸膏中氨基酸的含量具有显著性差异. 刘敬业等[24]利用氨基酸自动分析仪研究了不同生育时期、品种、施肥量、叶位以及烘烤前后烟叶氨基酸含量的变化规律. 赵田等[25]利用氨基酸自动分析仪，以四川8种烟草类型的调制后的烟叶为材料，针对不同类型烟叶游离氨基酸的组成和含量进行了比较分析，试验结果表明，烤烟和香料烟含量最高的两种氨基酸为脯氨酸和谷氨酸，白肋烟、马里兰烟、晒烟中含量最高的氨基酸为天门冬氨酸和谷氨酸.

3 结论

氨基酸检测技术不断发展，但是衍生化试剂选择和试验条件的优化等一系列问题还待解决. 氨基酸分析仪操作简便，但是分析时间长，且机器耗材价格偏高. 傅里叶变换红外技术对于低质量分数的氨基酸建模效果不理想. GC-MS用于氨基酸分析需要提前进行衍生化，易受衍生副产物的干扰. HPLC单独用于分析时需要衍生化，LC-MS/MS联用技术一般无需衍生处理，可以直接检测氨基酸，还有离子提取功能，有望成为氨基酸分析检测方法改进的方向. CE技术在手性氨基酸分析中有重要应用. 经过不断完善，前处理简单、选择性好、准确度高、分析速度快的氨基酸分析技术将会不断涌现.