氮素与盐碱胁迫互作对羊草-丛枝菌根共生体根系离子与有机酸含量的影响

王英男, 彭晓媛, 华晓雨, 杨春雪, 阎秀峰, 蔺吉祥

(1.东北林业大学 盐碱地生物资源环境研究中心/东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2.东北林业大学 园林学院，哈尔滨 150040)

羊草(Leymuschinensis)，又名碱草，属禾本科赖草属根茎型多年生禾草，广泛分布于俄罗斯的外贝加尔、蒙古国的东北部以及中国东北平原西部和内蒙古高原东部等地[1]。羊草是我国东北松嫩草地的建群种，既可分布在地带性的草甸草原和典型草原中，也可群生于非地带性的盐碱地以及低洼地段上[2]。近年来，随着环境的不断恶化以及人类活动的干扰，盐碱地面积也不断地扩大，严重制约着农业及畜牧业的发展。羊草具有生态适应性广，可塑性强，对干旱和盐碱化生境具有较高耐受性等优良特点[3]。因此，被认为是对盐碱地生物改良最有前景的牧草之一[4]。

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌广泛分布于各类陆地生态系统中，能与80%以上高等植物形成共生关系，促进宿主植物根系对土壤水分和矿质营养的吸收和利用，提高植物抗逆性，促进植物生长[5-8]。近年来，利用菌根技术提高宿主植物对盐碱胁迫环境的适应能力已经成为生物改良盐碱地研究中的热点领域。AM与宿主植物形成共生关系后，能够通过根外菌丝改变根形态结构，从而增加共生体根系的长度和养分吸收面积，提高宿主植物的水分含量，改善对矿质离子吸收等过程，进而影响宿主植物对盐碱胁迫的响应，从而提高宿主植物抗逆性[9]。

以往的研究多关注盐碱胁迫对植物—AM共生体的影响[10-12]，却忽略了大气氮沉降与盐碱胁迫的协同作用[13]。事实上，由于化石燃料的燃烧、氮肥施用等人为活动的增加，我国大部分地区存在高氮沉降现象，并已成为世界三大高氮沉降地区之一[14]。氮沉降增加对AM共生体的生长发育、根系及根外菌丝对养分的吸收均会产生显著影响，而关于氮沉降对植物—AM共生体抗逆性影响的研究还并不多见。基于此，本文以羊草根部为研究对象，探讨不同类型氮素对盐碱胁迫下羊草—AM共生体根系无机离子和有机酸含量的影响，一方面为利用羊草进行生物改良退化盐碱草地以及菌肥的应用提供科学依据，另一方面也为探求羊草—AM共生体对氮沉降及盐碱胁迫的响应和反馈提供必要的数据支持。

1 材料方法

1.1 材料与设计

本实验培养羊草幼苗基质为农田土、河沙混合(体积比3∶1)，培养基质置于高压蒸汽灭菌锅中(日本三洋公司，型号：MLS-3780)，在121℃、240 kPa条件下高温、高压灭菌2 h，以消除土壤中可能存在的真菌孢子及其它土壤微生物，风干备用。盆钵为塑料盆，上口内径15 cm，盆底内径12 cm，高12 cm，用10%的H2O2浸泡15 min，风干后每盆装灭菌混合土2 kg。接种所用的Glomusmosseae(BGC HEB02)由北京农林科学院植物营养与资源研究所提供。接种体由土壤、孢子、菌丝组成。接种处理将20 g接种物放入种子下方2 cm左右深的土层处，不接种处理每盆加入20 g灭菌的菌种。且不接种处理中施加20 ml未灭菌接种物水滤液，以保证不同处理间除AM真菌以外的微生物区系保持一致。

出苗120 d后，开始进行胁迫处理。本实验设置0 mmol/L(CK),100 mmol/L NaCl(S1),200 mmol/L NaCl(S2),100 mmol/L NaHCO3(A1),200 mmol/L NaHCO3(A2)5个处理组[15]。每组处理设置接种处理(+AM)、未接种处理(-AM)，3个氮水平：0 mmol/L(N0)、10 mmol/L NH4NO3(N1)、10 mmol/L NH4Cl∶NH4NO33∶1(N2)[16]，每个处理共4次重复，胁迫处理共7天。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 样品制备 将收获的幼苗用去离子冲洗，收集根样称重(鲜重FW)后，置于干燥箱中105℃ 杀青15 min，再于80℃烘干至恒重后称重(干重DW)，并计算含水量(M)，公式：

称取根干样0.05 g置于离心管中，加入10 ml去离子水，于沸水浴提取20 min，冷却后离心，上清液待测。

1.2.2 有机酸含量测定 试验用草酸、苹果酸、酒石酸、甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸均采用分析纯，测定时配置成一定浓度的标准液。

采用离子色谱法测定有机酸，离子色谱仪：美国DIONEX公司,型号：DX-300，附AI-450色谱工作站；色谱柱：ICE-AS6分析柱；电导检测器：CDM-Ⅱ；干扰抑制器：AMMS-ICEⅡ；移动相：0.4 mmol/L全氟丁酸；流速：1.0 ml/min；柱温：20℃。用一次性注射器吸取待测样品5 ml过微孔滤膜(水系，0.22 μm)后进样测定。试验用水为超纯水。

1.2.3 离子含量测定 羊草根阳离子采用原子吸收分光光度计测定(TAS-990, Purkinje General, 北京)，采用离子色谱法测定阴离子，离子色谱仪：美国DIONEX公司,型号：DX-300，附AI-450色谱工作站；色谱柱：AS4A-SC；电导检测器：CDM-Ⅱ；流动相：1.8 mmol/L Na2CO3/1.7 mmol/L Na2CO3；流速：2.0 ml/min；柱温：20℃。用一次性注射器吸取待测样品5 ml过微孔滤膜(水系，0.22 μm)后进样测定。试验用水为超纯水。试验用KNO3,NaCl,Na2SO4,NaH2PO4均采用分析纯，测量时配置成一定浓度的标准液。

1.3 数据分析

本试验数据处理采用SPSS软件(Version 13.0, SPSS Inc, Chicago, Illinois)，采用Duncan方法进行多重比较，显著水平为0.05。采用多因素方差分析检验接种AM真菌、盐碱胁迫与氮素形态的交互作用对羊草根系离子及有机酸的含量影响。采用Sigmaplot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 氮沉降对盐碱胁迫下羊草-丛枝菌根共生体根干重及含水量的影响

随着盐、碱胁迫浓度的升高，羊草根干重显著降低，且在碱胁迫下降幅更大，在高浓度盐碱胁迫下与对照组相比分别下降了15.9%,20.6%(p<0.05，图1A—1B)。接种AM真菌后，羊草根干重在盐碱胁迫下均有一定程度提高，但仅在盐胁迫下达到显著。氮素添加一定程度上降低了各处理中羊草根干重，且N2处理中羊草根干重较N1处理下降更为明显。如在100 mmol/L NaCl处理组中，N1处理与未施氮组相比仅下降了10%，而N2处理则使干重下降了35.1%。羊草根含水量的变化趋势与干重变化趋势基本相同(图1C—1D)。

注：图A，C为盐胁迫，图B，D为碱胁迫；不同小写字母表示差异显著(p<0.05)；***表示p<0.001,**表示p<0.01,*表示p<0.05,NS表示无显著差异，下图同。

图1氮沉降与盐碱胁迫下羊草根干重及含水量浓度的变化

2.2 氮沉降对盐碱胁迫下羊草-丛枝菌根共生体根中阳离子含量的影响

随着盐、碱胁迫浓度的升高，羊草根中Na+含量显著增加，且在碱胁迫条件下增加幅度更大(p<0.05，图2A—2B)。接种AM真菌显著降低了在盐、碱胁迫下羊草根中Na+含量(p<0.05)，在200 mmol/L NaCl处理下，Na+含量降低幅度最大(13.1%)。氮素添加使CK,200 mmol/L NaCl,100 mmol/L NaHCO3处理根中Na+含量显著提高(p<0.05)，且在高浓度盐胁迫处理中，N1,N2间差异显著(p<0.05)，与+AM处理相比分别提高了6%,11.8%。与Na+含量变化趋势相反，羊草根中K+含量随着盐、碱胁迫浓度的提高呈下降趋势，且在碱胁迫中下降幅度更为明显(图2C—2D)。接种AM真菌显著增加了在盐、碱胁迫下羊草根中K+含量(p<0.05)，在200 mmol/L NaHCO3处理下，K+含量增加幅度最大(41.9%)。氮素添加对CK处理中K+含量无显著影响；在碱胁迫处理中，氮素添加显著降低了根中K+含量(p<0.05)，且在200 mmol/L NaHCO3处理下，下降幅度最大(N1：11.7%，N2：28.2%)，而在盐胁迫处理中，仅N2处理显著降低了羊草根中K+含量(p<0.05)。

随着盐、碱胁迫浓度的提高，羊草根中Ca2+,Mg2+含量均显著增加(p<0.05)，且在碱胁迫条件下增加幅度均更为明显(图2E—2H)。除200 mmol/L NaCl处理Ca2+,Mg2+及200 mmol/L NaHCO3处理Ca2+含量较-AM处理显著降低外，其他处理中接种AM真菌对Ca2+,Mg2+含量并未产生显著影响。氮素添加小幅提高了羊草根中Ca2+,Mg2+含量，但除在高浓度盐、碱胁迫外，其他处理中均未达到显著水平。

图2 氮沉降与盐碱胁迫下羊草根中Na+，K+，Ca2+，Mg2+及镁离子浓度的变化

2.3 氮沉降对盐碱胁迫下羊草-丛枝菌根共生体根中阴离子含量的影响

2.4 氮沉降对盐碱胁迫下羊草-丛枝菌根共生体根中有机酸含量的影响

本实验中，我们在羊草根中分别检测到了柠檬酸、苹果酸、乙酸、草酸4种有机酸。随着盐、碱胁迫浓度的上升羊草根中柠檬酸含量呈显著上升趋势(p<0.05)，但在碱胁迫处理下上升趋势更为明显。接种AM真菌使羊草根中柠檬酸含量显著降低(p<0.05)。在盐胁迫处理组中，氮素添加使柠檬酸含量显著降低(p<0.05)，但N1,N2处理的降低幅度并无明显差异。而在碱胁迫处理组中，当胁迫浓度高于100 mmol/L时，氮素添加显著提高了羊草叶片柠檬酸含量(p<0.05)，其中N1处理提高了23.6%，N2提高了26.2%(图5A—5B)。随碱胁迫浓度的提高羊草根中苹果酸、乙酸含量均呈显著上升趋势(p<0.05)。在盐胁迫下，接种AM真菌及氮素添加均未对根中苹果酸、乙酸含量产生显著影响。在碱胁迫处理中，接种AM真菌仅使苹果酸含量显著降低(p<0.05)，而对乙酸含量并无显著影响；与接种AM真菌的影响相反，氮素添加使乙酸含量显著增加(p<0.05)，而对苹果酸含量无显著影响(图4D—4F)。

3 讨 论

图3 氮沉降与盐碱胁迫下羊草根中浓度的变化

图4 氮沉降与盐碱胁迫下羊草根中柠檬酸、苹果酸、乙酸及草酸含量的变化

4 结 论

综上所述，在盐碱胁迫下AM真菌能够改变植物体内无机离子与有机酸含量，进而改善宿主植物根部的渗透平衡、减轻离子毒害，大幅提高宿主植物的耐盐碱能力，从而缓解盐碱胁迫对植物根部的伤害，有利于植物在盐碱环境下的生长。氮沉降的增加对丛枝菌根共生体的耐盐碱能力产生了一定程度的削弱，且铵态氮为主导的氮沉降削弱作用更为显著。