嗜酸乳杆菌IMAU30067增殖培养基的研究

赵燕霞，王元弛，姚国强，赵洁，尤利军，杨瑞冬，李伯海，孙天松

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室,农业部奶制品加工重点实验室,呼和浩特010018）

0 引 言

嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）属革兰氏阳性细菌，产生细菌素、有机酸和过氧化氢等多种天然抑菌物质，具有调节肠道菌群、缓解乳糖不耐症、增强机体免疫力、缓解过敏、降低胆固醇、改善呼吸道感染等作用[1-6]。研究发现在肠道菌群中，糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、硝基还原酶的存在会把前致癌物激活成致癌物，而嗜酸乳杆菌能够降低这些酶的水平[7]。嗜酸乳杆菌作为第三代酸奶发酵剂菌种，现已获得美国食品药物管理局和我国卫生部批准,是可用于功能性食品中的益生菌种之一[8]。当嗜酸乳杆菌的活菌数达到1×106CFU/mL时，能维持人体肠道中微生物的平衡[9]。

嗜酸乳杆菌在食品工业中有很多应用，肉、奶、水果、蔬菜和谷物等天然食物可以分离出嗜酸乳杆菌。嗜酸乳杆菌可加工多种发酵乳制品,如酸乳饮料、酸奶酪、酸奶等。用嗜酸乳杆菌发酵雪菜、果蔬汁,可提高其营养价值,改善风味,延长保存期。嗜酸乳杆菌发酵豆乳可以减少豆腥味和豆臭味,增加大豆异黄酮水平，同时保留植物蛋白原有的营养成分和保健功能[10-11]。嗜酸乳杆菌发酵牛乳，可以开发具有健康功效和不同风味特征的嗜酸乳杆菌乳制品。

本研究采用单因素试验、正交试验、响应面法对嗜酸乳杆菌IMAU30067的增菌培养基成分和培养条件进行筛选和优化，确定适合IMAU 30067菌体生长的增殖培养基及培养条件，为后期高密度培养提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

嗜酸乳杆菌IMAU30067分离自新疆传统发酵酸马奶，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库提供。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基，参照文献[12]配制。1.1.3 仪器与设备

SHIMADZU UV-1700型紫外可见分光光度计，日本岛津株式会社分析仪器部；DG250型厌氧工作站Don Whitley Scientific；GUJS-5L×3全自动机械搅拌发酵罐，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

取冻存IMAU 30067脱脂乳管接入MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18 h，活化三代。

1.2.2 IMAU 30067菌体生长特性检测

菌体密度测定：紫外可见分光光度计于600 nm波长下测发酵液的菌体密度。

活菌数测定：采用平板菌落计数法，37℃厌氧培养72 h。

1.2.3 IMAU 30067培养基成分优化

在MRS培养基的基础上选取葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、水苏糖、海藻糖等取代MRS中的碳源；选取大豆蛋白胨、小麦水解蛋白、牛肉膏、牛肝浸膏、牛肉蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白胨、脱盐乳清粉、脱脂乳粉、酵母浸粉、酵母蛋白胨等取代MRS中的氮源；根据菌体生长情况确定适宜的碳氮总量和碳氮比；在上述优化好的碳氮源基础上，选取柠檬酸钠/乙酸钠/K2HPO4、Na2HPO4/NaH2PO4、Na2HPO4/柠檬酸、Na2HPO4/KH2PO4、柠檬酸/柠檬酸钠等缓冲盐体系取代MRS中的缓冲盐；以及添加不同的微量元素(Mg2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+)、植物浸提物（马铃薯、山药、香菇、番茄、豌豆、玉米、麦芽、胡萝卜）、氨基酸（丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、缬氨酸），分别以1×106CFU/mL的接种量于37℃厌氧培养18 h，根据菌体生长情况，确定促进嗜酸乳杆菌IMAU 30067生长的最佳培养基成分。

1.2.4 IMAU 30067培养基主成分比例优化

IMAU 30067生长的主要影响因素包括碳源、氮源和缓冲盐,对这三种成分进行中心组合设计和响应面分析，确定IMAU30067培养基中主要成分的最优配比。

1.2.5 IMAU 30067静态培养条件优化

采用正交试验研究不同温度、初始pH和接种量对IMAU30067生长情况的影响，确定最佳静态培养条件。

1.2.6 发酵罐小试发酵

将IMAU 30067在5L全自动发酵罐中进行小试发酵试验，对优化后的培养基成分及静态培养条件进行验证，同时为后期高密度培养提供基础数据。

2 结果与分析

2.1 IMAU 30067培养基成分优化结果

2.1.1 碳源优化结果

在MRS培养基的基础上根据伯杰细菌手册中乳杆菌属内种的碳水化合物反应选取IMAU 30067能利用的11种碳源进行菌体密度的测定。

表1 不同碳源对嗜酸乳杆菌IMAU30067菌体密度的影响(n=4,x±D)

从表1可知IMAU 30067对葡萄糖、麦芽糖、海藻糖的利用能力最强，但三者之间无显著性差异(P＞0.05)，故进行复配实验，正交设计结果见表2。

从表2看出三因素的极差值为RA＞RB＞RC，三种碳源物质对于IMAU 30067生长影响的主次关系为：葡萄糖＞麦芽糖＞海藻糖，三种碳源物质的最优配比为A2B3C1，即葡萄糖0.75%、麦芽糖0.75%、海藻糖0.5%。优化碳源后其活菌数可达8.850×107CFU/mL。

2.1.2 氮源优化结果

蛋白胨中含有蛋白质、自由氨基酸、多肽、糖类、脂肪和生长因子，能更好的促进嗜酸乳杆菌的生长。根据成本低廉和具有工业化生产潜力的原则选取13种氮源进行菌体密度的测定。

从表3可知，鱼蛋白胨和大豆蛋白胨为氮源时，IMAU 30067菌体密度显著高于其他氮源(P＜0.05)，但二者之间无显著性差异。复合氮源比单一氮源更能促进嗜酸乳杆菌的生长，故设计复配试验，结果见表4。

由表4可知，当大豆蛋白胨和鱼蛋白胨的复配比为1∶3时，IMAU 30067对两种氮源的利用率最强，且与其他复配比相比有显著差异(P＜0.05),其活菌数可达1.15×108CFU/mL。

表2 碳源L9（34）正交试验

表3 不同氮源对嗜酸乳杆菌IMAU30067菌体密度的影响(n=4,x±D)

表4 不同氮源复配比对嗜酸乳杆菌IMAU30067的影响(n=4,x±D)

2.1.3 碳氮总量及碳氮比优化结果

碳氮比对菌株生长有重要作用，直接影响其生长和发酵产物的积累。碳氮比过高时，会影响菌体的增殖，增加表多糖的产生[13-14]。有报道表明碳氮比在0.5～2.0时，菌体生长情况良好[15]。

图1 不同碳氮总量及比例对嗜酸乳杆菌IMAU30067菌体密度的影响

由图1可知，IMAU 30067在碳氮比为2∶1的培养基中生长状况较好，这种现象在不同碳氮总量的情况下均出现。IMAU30067在碳氮总量由3%增长到12%的过程中，菌体密度相应增加，并在12%之后随着碳氮总量的增加菌体密度下降。故选择最优碳氮总量12%、碳氮比2∶1。此时活菌数可达2.29×108CFU/mL。

2.1.4 缓冲盐优化结果

乳酸菌在生长过程中代谢糖产生乳酸，使乳酸菌生长过程中培养液的pH值不断降低，酸性增强，从而抑制乳酸菌的生长，使菌体易受到损伤甚至死亡。培养基中添加适量的缓冲盐中和培养液中的酸性物质，缓减菌液pH下降的速率。同时，缓冲盐中一些离子可参与菌体细胞的合成代谢活动，调节细胞渗透压平衡，促进菌体生长。

图2 嗜酸乳杆菌IMAU30067在不同缓冲盐体系下的菌体密度(n=4,x±D)

由图2可知，分别添加柠檬酸钠/乙酸钠/K2HPO4、Na2HPO4/NaH2PO4、Na2HPO4/柠 檬 酸、Na2HPO4/KH2PO4这四对缓冲对时，均会不同程度的促进IMAU30067生长，其中添加0.06 mol/L的柠檬酸钠/乙酸钠/K2HPO4菌体密度最高，对菌株生长有明显的促进作用。因此将0.06 mol/L的柠檬酸钠/乙酸钠/K2HPO4作为IMAU 30067增殖培养基的缓冲盐，优化缓冲盐后菌体活菌数可达2.73×108CFU/mL。

2.1.5 微量元素优化结果

Fe、Mg、Cu、Mn、Zn等微量元素作为酶的激活剂或生物活性物质的组成成分是微生物生长繁殖过程中不可缺少的。由图3可知，添加0.8 g/L的MgSO4·7H2O对菌体的促生长作用最明显。镁离子是生物体内多种新陈代谢活动所必须的阳离子。Mg2+可加速细胞的代谢活动，同时加速降解蛋白质这类不能直接利用的有机大分子。在菌体增殖过程中，物质透过细胞膜运输以及生物合成均需要消耗ATP，ATP的合成对乳酸菌的生长至关重要，而适当浓度的Mg2+可以促进ATP的生成[16]。因此，实验最终选用0.8 g/L的MgSO4·7H2O。

图3 微量元素对嗜酸乳杆菌IMAU30067菌体密度的影响

2.1.6 植物提取物优化结果

植物提取物中含有一些乳酸菌生长繁殖所需的基本营养物，例如矿物质、维生素、抗氧化剂和膳食纤维，能满足乳酸菌对营养的需求，可促进其生长[17]。天然果蔬在研磨糊化或榨汁调配的过程中会导致营养成分的丢失，同时使培养基配制步骤增加，操作繁琐，不适合工业化生产[18]。而植物提取物以植物为原料，经过物理化学的提取分离，定向获取和浓集植物中的有效成分，不改变其有效成分结构的一类物质。天然产物中提取出的植物提取物具有抗氧化和清除自由基活性物质的特点。

图4 植物提取物对嗜酸乳杆菌IMAU30067菌体密度的影响

由图4可知，8种植物提取物均可不同程度的促进嗜酸乳杆菌的生长，当提取物的浓度为0.6%时，菌体密度均达到最高。植物提取物的浓度过高或过低都会抑制嗜酸乳杆菌IMAU 30067的生长，从而使其活菌数降低[19]。高浓度的玉米和麦芽提取物会抑制IMAU 30067的生长。由于马铃薯的促生长明显高于其他植物提取物且浓度在0.6%时菌体密度最高，因此选取0.6%的马铃薯提取物作为IMAU 30067的天然促生长因子。此时菌体的活菌数可达2.97×108CFU/mL。

2.1.7 氨基酸优化结果

乳酸菌菌体细胞内缺乏各种生物合成系统，需要依赖生长环境供应某些氨基酸。

表5 氨基酸对嗜酸乳杆菌IMAU30067菌体密度的影响(n=4,x±D)

表5反映了IMAU 30067对13种氨基酸的利用情况，与空白对照相比，添加0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L的组氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、异亮氨酸均有增菌效果，其中添加0.1g/L的组氨酸增菌效果最显著（P＜0.05），菌体密度为9.347。添加丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸对嗜酸乳杆菌有抑制作用。王磊等[20]研究发现蛋氨酸对嗜酸乳杆菌有促进作用，丙氨酸、缬氨酸对嗜酸乳杆菌有抑制作用。乳酸菌在含有氨基酸的培养基中生长可从中吸收相容性物质，这些相容性物质加强水分子与细胞内生物大分子物质的亲和性，维持蛋白质结构和酶活性从而提高菌株的生存能力[21-22]。白凤翎等[23]研究表明在嗜酸乳杆菌增殖培养基中添加氨基酸可以提高氮源利用率。根据菌体密度可知，0.1g/L的组氨酸对嗜酸乳杆菌IMAU 30067的促生长作用最明显，优化氨基酸后的菌体活菌数可达3.27×108CFU/mL。

2.2 响应面法(RSM)优化结果

响应面法(RSM)能快速、有效的对主要影响因子进行优化与评价,确定各因子水平的最佳组合和响应面的最优值。目前,响应面法已被广泛用于培养基成分、发酵条件的相关研究[24-26]。中心组合设计和响应面分析相结合可以确定最优实验条件[27]。

实验以菌体密度为评价指标，依据旋转中心组合设计添加至优化后的基础培养基，具体设计及结果见表6。

实验采用Design Expert 8.0软件响应面分析程序进行二次多项回归拟合，获得3种关键生长因子与菌体的二次多项式回归模型方程：

表6 旋转中心组合设计及结果

OD=10.64+0.33A+1.35B+0.55C+0.065AB+0.05AC-0.38BC-1.19A2-1.77B2-1.49C2

各项方差分析结果如表7所示。

表7 二次多项式模型的系数及其方差分析

对二次模型进行方差分析，结果显示二次项A2、B2、C2以及交叉项BC对嗜酸乳杆菌IMAU 30067菌体密度有显著影响(p＜0.01)。整体模型显著(p＜0.01)，失拟项的P值为0.5093＞0.05，可知失拟项不显著。该模型的系数R2=0.9996，Radj2=0.9993,表明响应面的99.93%的变化可以由此模型解释，模型与实验的拟合度较高，可用于嗜酸乳杆菌IMAU 30067的生长增值情况预测。

图5 各因素交互作用响应面图以及相应的等高线图

由二次多项方程得到的响应面的二维等高线和三维立体图如图5所示，等高线图的圆心越接近椭圆表示交互作用越强，等高线的稀疏表示响应面图形的平陡。对采用响应面法得到的最终培养基中碳源80.00 g/L、氮源40.00 g/L、缓冲盐10.32 g/L，模型预测最大菌体密度为10.73。采用上述最优添加量培养IMAU 30067，37℃培养18 h，IMAU 30067实际菌体密度为10.64，可见该模型能够较好的预测嗜酸乳杆菌IMAU 30067的菌体生长情况。

2.3 静态培养条件优化结果

在培养基成分优化后，采用正交试验确定嗜酸乳杆菌IMAU30067的静态培养条件（温度、pH、接种量）。结果如表8所示。

实验结果见表8，通过对三个因素的极差分析，静态培养条件对嗜酸乳杆菌的影响顺序为：A(温度)＞B(p H值)＞C(接种量)，最佳的增菌培养基配方为A2B3C1，即嗜酸乳杆菌最优静态培养条件为：温度为37℃，pH 6.5，接种量1×106CFU/mL。在此条件下进行静态培养，嗜酸乳杆菌经37℃静置培养18 h后进行平板计数，活菌数达到3.85×108CFU/mL。

2.4 5L发酵罐发酵试验结果

乳酸菌高密度培养过程中不适当的pH会抑制菌体某些酶活性使菌体的新陈代谢受阻，需要确定合适的恒p H来延长菌体的对数生长期、减轻过酸对菌体的抑制、提高菌体密度从而增加菌泥产量。

Kang等[28]研究表明，pH 5.0-6.0时利于菌体的生长。由表9可知，通过选择不同的恒pH值，记录菌体密度、发酵耗碱量、发酵时间以及活菌数的变化，当恒p H为5.0时菌体密度、活菌数最高有利于增加菌泥的产量,同时发酵耗碱量最低可以降低成本。恒pH为6.0时发酵时间最短，但其活菌数太低会导致产量降低，综合考虑，最佳恒pH值为5.0。

表8 静态培养条件L9（34）正交试验

表9 发酵pH值对嗜酸乳杆菌IMAU30067的影响

图6 不同培养类型对嗜酸乳杆菌IMAU30067活菌数及菌体密度的影响

由图6可知，分别在MRS培养基、静态优化培养基以及优化培养基的发酵罐小试中培养嗜酸乳杆菌IMAU30067，菌体在5L发酵罐中生长的菌体密度和活菌数是极显著的(P＜0.01)，其活菌数为3.72×109CFU/mL是静态优化培养基的9.6倍，是MRS培养基的82.6倍。

近年来，含有嗜酸乳杆菌的乳制品深受消费者的欢迎，进而掀起国内外研究学者对嗜酸乳杆菌培养基增菌研究的热潮，增菌过程中所采取的试验方法也多种多样。施大林[29]等采用正交试验优化嗜酸乳杆菌培养基，其主成分为蔗糖2.0%、蛋白胨1.5%、酵母膏0.5%，活菌数可达9.3×108CFU/mL。熊涛[30]等通过中心组合试验，确定影响嗜酸乳杆菌生长的三个主成分为乳糖1.766%、番茄汁31.602%、牛肉膏1.458%，最终活菌数可达2.88×109CFU/mL，乳糖浓度过高会产生大量乳酸，抑制菌体的生长，而番茄汁的需求量太大、制作过程中会损失营养成分同时会增加成本，不适合工业化生产。Lee等[31]利用响应面法确定嗜酸乳杆菌的培养基的主成分配方为乳糖17.7 g/L，酵母提取物18.6 g/L，CaCl20.9 g/L，活菌数可达9.33 Log CFU/mL，其中CaCl2对菌体生长的影响最大，CaCl2能够改变菌体细胞壁的通透性，同时也是许多种酶的激活剂。Pedram等[32]通过Box-Behnken试验对嗜酸乳杆菌培养基主要成分葡萄糖，酵母提取物，KH2PO4进行优化，4%的酵母提取物对菌体生长的影响最大，实际生产中酵母提取物的开发过程复杂，不适合工业化应用。Chen等[33]通过Plackett-Burman和最陡爬坡试验使嗜酸乳杆菌活菌数达到2.72×109CFU/mL，Plackett-Burman和最陡上坡试验可提高培养基优化的准确性。Meena等[34]在嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合优化培养中采用人工神经网络技术（ANN）、遗传算法（GA）构建系统模型，确定6个影响最大的因子最大值和最小值并进行组合,优化结果为碳源42.31%、氮源14.20%、培养时间30 h、培养温度38℃、pH6.5、接种量1.6%，同时Meena在试验中验证人工神经网络技术（ANN）和遗传算法（GA）两者结合应用更灵敏、更精准。本试验获得的配方中含氮源4%、碳源8%，碳氮含量较合理，培养基成本低，同时选取的马铃薯提取物是经过物理化学的提取分离，浓集马铃薯中的有效成分，适合工业化应用。本试验采用中心组合设计和响应面分析相结合的方法，快速有效的确定了主成份的最优含量。综合上述结论，嗜酸乳杆菌IMAU 30067的增殖培养基工艺可以为后期高密度培养提供基础数据。

3 结 论

实验通过单因素试验、正交试验和响应面法确定嗜酸乳杆菌IMAU30067的最优配方为：葡萄糖30.00 g/L、麦芽糖30.00 g/L、海藻糖20.00 g/L、鱼蛋白胨30.00 g/L、大豆蛋白胨10.00 g/L，柠檬酸钠2.29 g/L、乙酸钠5.74 g/L、K2HPO42.29 g/L、MgSO4·7H2O 0.80 g/L、马铃薯提取物6.00 g/L、组氨酸0.10 g/L。嗜酸乳杆菌IMAU 30067最佳培养条件为：接种量1×106CFU/mL、初始pH值6.5，于37℃恒pH 5.0厌氧培养，优化后其活菌数达3.85×108CFU/mL。利用优化好的培养基进行5 L发酵罐小试试验，发酵液活菌数可达3.72×109CFU/mL，是静态优化培养基的9.6倍，是MRS培养基的82.6倍(优化前MRS活菌数为4.50×107CFU/mL)。试验中培养基所选成分成本低、碳氮源均采用复配从而营养成分丰富、活菌数多，同时操作工艺简单具有工业化生产潜力。