HPLC法测定小叶山葡萄叶中白藜芦醇含量

何恩铭，田 淼，沈瑞池，任育军，汪文华

(1.福建省亚热带植物研究所/福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006；2.福建农林大学生命科学学院分子细胞与系统生物学中心，福建 福州 350002)

小叶山葡萄Vitis thunbergiivar.taiwaniana是葡萄科葡萄属植物，又称细本山葡萄、小本山葡萄、野葡萄等，主要分布在中国台湾地区，是当地传统中药材，已被研制成多种保健产品[1]。研究发现，小叶山葡萄根和茎所含的白黎芦醇[2]有抗菌[3]、抗炎[4]、抗血栓[5—6]、降脂[7]、保肝[8]、预防心血管疾病[9]、抗癌[10]、抗衰老等功效[11]，还可改善脑神经退化性疾病，具有较强的神经保护作用[12—14]，是一种极具药用潜力的植物次级代谢产物，市场需求较大。小叶山葡萄的传统药用部位是根和茎，叶子大多作为废弃物处理，造成较大的浪费。小叶山葡萄叶茂盛，叶产量远大于根产量，且可年年收获，对叶的生物活性成分进行分析，将叶变废为宝，可为小叶山葡萄资源的合理利用开辟新途径。

目前，白藜芦醇的检测方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、毛细管电泳法、荧光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法(HPLC)等[15—17]。高效液相色谱法具有分离效率快、灵敏度高、适用于检测热不稳定成分等优点[17]。现基于HPLC法对小叶山葡萄叶中白藜芦醇含量进行测定，以期为小叶山葡萄资源的进一步研究和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：小叶山葡萄叶采收自福建省亚热带植物研究所小叶山葡萄苗圃，将其于60 ℃烘干48 h，粉碎过20目筛备用。

主要仪器：Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters)、UV-9100紫外-可见分光光度计(上海佳胜实验设备有限公司)、Milli-Q纯水机(德国Millipole)、精密电子天平、索式提取器、旋转蒸发仪、冷却浸提装置、电热恒温水浴锅、万能粉碎机、烘箱、40目标准筛等。

主要试剂：白藜芦醇对照品(98%)，购自美国Sigma公司；HPLC测试用甲醇为色谱纯，提取白藜芦醇用的甲醇为化学纯，超纯水为实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 白藜芦醇储备液制备 精密称取白藜芦醇标准品5.0 mg，用甲醇溶解，置于25 mL 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀配成白藜芦醇储备液200 μg·mL-1。

1.2.2 供试品溶液制备 精确称取小叶山葡萄粉末1 g，置于50 mL锥形瓶中，加甲醇30 mL，超声波(功率150 W，频率20 kHz)提取15 min，过滤，收集滤液；同法再提取2次，合并提取液，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，过滤即得供试品溶液。

1.2.3 检测波长确定 分别取适量对照品溶液，用甲醇稀释至适宜浓度，以对照品溶液作空白对照，用UV-9100紫外-可见分光光度计对白藜芦醇标准品在200～400 nm波长范围内全扫描，采样间隔1 nm，中速，根据扫描吸收峰情况确定白藜芦醇的检测波长。

1.2.4 高效液相色谱条件 Waters高效液相色谱仪，色谱柱Hypersil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，检测波长306 nm，流动相甲醇-水(72:28)，流速1 mL·min-1，进样量10 μL。

1.2.5 白藜芦醇标准曲线绘制 准确吸取白藜芦醇对照品储备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀配成20 μg·mL-1对照品溶液。准确吸取对照品溶液分别以5、10、25、50和100 μL体积进样，按照1.2.4色谱条件进行测定，记录色谱图及峰面积。

1.2.6 白藜芦醇测定方法学评价 按照1.2.4色谱条件，进行精密度、稳定性、重现性、加样回收率等方法学考察试验，评价HPLC法测定小叶山葡萄叶中白藜芦醇含量的效果。

1.2.7 样品中白藜芦醇测定 精密量取小叶山葡萄叶的提取溶液样品10 μL，分别进样测定峰面积，每份溶液重复进样3次。用回归方程计算各样品中白藜芦醇含量，结果取平均值，根据标准曲线计算样品中白藜芦醇含量。

2 结果与分析

2.1 检测波长

由波长200～400 nm之间扫描的紫外吸收光谱图可以看出，白藜芦醇标准品溶液在306 nm处有强吸收峰，故选用波长306 nm作为白藜芦醇的检测波长(图1)。

2.2 白藜芦醇标准曲线

按照 1.2.4色谱条件进行测定，记录色谱图及峰面积。以样品含量为横坐标 x(μg·mL-1)、峰面积y(AU·min-1)为纵坐标，绘制标准曲线(图2)。用最小二乘法线性回归得白藜芦醇回归方程：y=73.523x+21.564，R2=0.9999。测定结果表明，白藜芦醇对照品含量在10～200 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

图1 标准品溶液的紫外吸收光谱图Fig.1 UV absorption spectrum of the reference standard

图2 标准曲线Fig.2 The standard curve

2.3 高效液相色谱图

按照1.2.4色谱条件进行测定，白藜芦醇对照品和小叶山葡萄叶提取液的HPLC色谱图如图3、图4，二者在试验采用的色谱条件使白藜芦醇的出峰时间适中，峰型较好不拖尾，其保留时间为16.25 min。

图3 白藜芦醇对照品HPLC色谱图(tR=16.25 min)Fig.3 HPLC chromatogram of resveratrol control ample(tR=16.25 min)

图4 小叶山葡萄叶提取液的HPLC色谱图(tR=16.25 min)Fig.4 HPLC chromatogram of control sample (tR=16.25 min)

2.4 精密度试验

将1.2.5项配制的20 μg·mL-1小叶山葡萄对照品溶液连续进样5 次，每次10 μL，结果如表1。峰面积的RSD(n=5)为0.77 %，表明仪器精密度良好。

2.5 重现性试验

分别准确称取5份小叶山葡萄叶样品粉末，每份1 g，按1.2.2方法提取白藜芦醇，分别定容至100 mL，将供试品溶液分别进样20 μL，峰面积测定结果见表 2。峰面积的RSD(n=5)为 0.41%，操作方法的误差在可接受范围内，说明该方法的重现性较好。

表 1 精密度试验结果Table 1 Results of precision test

表2 重现性试验结果Table 2 Results of reproducibility test

2.6 稳定性试验

准确称取1 g小叶山葡萄叶样品粉末，按1.2.2方法提取白藜芦醇，分别定容至100 mL，于室温(28 ℃左右)中放置，在2 h、4 h、8 h、12 h、24 h不同时间段，每个时间段进样一次，每次进样15 μL，然后分别按优化的色谱条件进行测定，计算得到RSD为0.21%(表3)，表明样品溶液在室温条件下24 h内能稳定保存。

表3 稳定性试验结果Table 3 Results of stability test

2.7 加样回收率试验

取5个10 mL容量瓶，每个容量瓶中各加入已经测定含量的小叶山葡萄供试品溶液1 mL，再分别加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL白藜芦醇标准品溶液(浓度20 μg·mL-1)，加甲醇定容至刻度，摇匀后，在2.2的色谱条件下分别进样，计算平均回收率。由表4可知，回收率的平均值为99.92%，RSD=0.39%，表明此方法回收率良好。

表4 加样回收率的测定结果Table 4 Determination results of recovery

2.8 样品中白藜芦醇的测定

精密量取小叶山葡萄叶的提取溶液样品10 μL，分别进样测定峰面积，每份溶液重复进样3次。用回归方程计算各样品中白藜芦醇的含量，结果取平均值，根据标准曲线计算样品中白藜芦醇的含量，测得小叶山葡萄叶中白藜芦醇含量为956.43 μg·g-1DW。

3 结论

本文建立了一种高效液相色谱法(HPLC)测定小叶山葡萄叶中白藜芦醇含量的检测方法。色谱条件：Waters高效液相色谱仪，Hypersil C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相甲醇-水(72:28)，流速1 mL·min-1，检测波长306 nm。在上述色谱条件下，白藜芦醇含量在10～200 μg·mL-1范围内线性关系良好，相关系数r为0.9999，精密度、重现性、稳定性RSD(n=5)分别为0.77%、0.41%、0.21%；平均加标回收率为99.92%，相对标准偏差为0.39%。该方法线性关系、精密度、稳定性、重现性、回收率等均达到分析实验要求，可用于小叶山葡萄叶中白藜芦醇的定量和定性分析。