响应面法优化藠头抑菌成分提取工艺

吴 琴，伍 玲，陈 谦，杨 敏，高 鹏，陈 浩，黄 敏

（四川省原子能研究院/辐照保藏四川省重点实验室，四川成都 610101）

藠头（Allium chinense），别称薤，百合科葱属植物［1］，广泛分布于我国南方地区。藠头富含多种活性物质、维生素、矿物质及人体必需氨基酸，营养价值非常高，是药食同源珍品，素有“菜中灵芝”之美誉［2］。据李时珍《本草纲目》记载，藠头具有杀菌、健胃、平喘以及治疗心脑血管疾病等功效［3］。现代医学研究表明，藠头具有开胃健脾、调节肠道、增进食欲和杀菌止泻等多种功效［4］，具有很大的开发潜力，已被国家农业部发布的《特色农产品区域布局规划（2013—2020）》列为重点发展农产品之一。但目前我国的藠头加工还处于初级阶段，多被简单腌制用以佐餐，产品形式单一，不利于藠头精深加工产业的发展。通过提取藠头中的活性物质再加以利用，充分开发其价值，提高其加工附加值，丰富产品形式，对于带动整个藠头产业的发展具有重要意义［5］。大量研究表明，藠头对多种致病菌都有明显的抑制作用，具有开发抗真菌药物和食品防腐剂的潜力［6-7］。此前普遍认为，葱属植物的主要抑菌成分为含硫化合物——蒜素（allicin），相关研究也主要集中于蒜素的提取及纯化等方面［8-10］。我国药典记载，中药薤白为新鲜鳞茎用水浸煮或蒸过后干燥而成，中医临床上使用的是薤白水煎剂，而经浸煮与干燥加工后，由于挥发性强，含硫化合物在干燥药材和汤药中其实已经残留不多，因此很难说含硫化合物是藠头的主要抑菌成分［11］。陈艳丽的研究结果表明，以藠头加工废弃物为原料获取的蒜素提取液其抑菌能力不显著［12］。且有报道表明，藠头中的皂苷类化合物也具有一定抑菌效果［13］，可见，藠头的抑菌功效可能是多种成分的共同作用，单独以蒜素含量作为藠头抑菌成分提取优化的指标并不适宜，直接以抑菌效果作为其评价指标理应更加可靠。因此，本试验以藠头提取液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制效果为指标对其提取条件进行研究，通过响应面设计优化藠头抑菌成分的提取工艺，以期为以藠头为来源的天然抑菌剂的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜藠头，购自四川省成都市内农贸市场；纤维素酶［滤纸酶活力≥4万U/g；CMCNa活力≥100万U/g；C1酶活力≥3万U/g，1 g酶粉于50℃、pH值为4.8条件下，1min水解底物（滤纸、CMC、脱脂棉或水杨素）产生1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位］、中性蛋白酶（酶活≥10万U/g，1 g固体酶粉在40℃、pH值为7.5条件下，1 min水解酪素产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位）和果胶酶（酶活≥3万U/g，1 g酶粉于50℃、pH值为3.5条件下，1 h催化果胶水解生成1 mg半乳糖醛酸的酶量为1个果胶酶活力单位），均购自于宁夏和氏璧生物技术有限公司；无水乙醇（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、盐酸（分析纯），均购自成都市科龙化工试剂厂；菌种：金黄色葡萄球菌（S.aureus），由笔者所在实验室保藏；营养琼脂（NA）培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

HH数显恒温水浴锅（江苏省金坛市金城国胜试验仪器厂）、BSA224S-CW 电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、Eppendorf centrifuge 5810R 高速离心机（德国Eppendorf股份公司）、ELELA FDU-2110冷冻干燥机（ELELA日本东京理化株式会社）、Mettler-Toledo-S210 pH计［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］、DNP-9272电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 藠头粗提液的制备［7］将新鲜藠头清洗除杂，晾干，紫外照射15 min灭菌，用搅拌机破碎，按比例加入提取溶剂混匀，调节混合物pH值，搅拌状态下水浴浸提一定时间，提取液经4层纱布过滤，8 000 r/min离心5 min，取上清液，即为藠头粗提液。

1.3.2 抑菌试验 供试菌种划线2次，挑取生长旺盛的菌落接种于液体NA培养基中，在温度为36℃，150 r/min条件下培养24 h。将活化的金黄色葡萄球菌以生理盐水稀释成106CFU/mL的菌悬液，取100μL菌悬液涂布于相应培养基平板上，其上间隔均匀放置牛津杯，在牛津杯中分别加入0.2 mL藠头粗提液，以无菌水为对照，每个样品重复3次，37℃恒温培养24 h后，测量抑菌圈直径［13］。

1.3.3 藠头预处理方法对其抑菌成分的影响 称取4份相同质量（50 g）的新鲜藠头，分别在温度为4℃条件下冷藏1个月、-18℃冷冻1个月、40℃热风完全干燥、4%（质量比）NaCl盐渍处理后真空包装贮藏1个月，按“1.3.1”节中的方法在相同条件下进行提取，以新鲜藠头为对照，按“1.3.2”节中的方法测定不同预处理藠头提取物的抑菌效果。

1.3.4 藠头抑菌成分提取方法 热水浸提法：称取50 g新鲜藠头，破碎后加入50mL超纯水混匀，混合物搅拌状态下于50℃水浴中保持1 h。

乙醇提取法：称取50 g新鲜藠头，破碎后分别加入50 mL浓度为50%（体积比）的乙醇溶液混匀，混合物搅拌状态下于50℃水浴中保持1 h。

酶辅助提取法：称取50 g新鲜藠头，破碎后分别加入50 mL超纯水混匀，混合物分别加入藠头干质量0.5%（质量比）的中性蛋白酶（pH值＝7.5）、纤维素酶（pH值＝4.8）、果胶酶（pH值＝3.5），以0.1 mol/L HCl调节pH值，搅拌状态下于50℃水浴1 h。

将提取液按“1.3.2”节中所述进行抑菌试验，考察不同提取方法对藠头提取物抑菌效果的影响。

1.3.5 果胶酶辅助提取藠头抑菌成分的单因素试验 称取50 g新鲜藠头，分别考察pH值［3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、自然pH值（6.0）］、果胶酶添加量（0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%）、提取时间（30、45、60、75、90 min）、水浴温度（40、45、50、55、60℃）、料液比［1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）］对藠头提取物抑菌效果的影响。

1.3.6 响应面试验设计 根据单因素试验结果，选取对提取物抑菌效果影响较为显著的因素（提取时间、料液比、pH值）为响应变量（表1），以提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小为响应值，利用Design-Expert 8.0软件中Box-Behnken中心组合试验设计进行响应面分析，优化藠头抑菌成分提取的工艺条件，从而得到最佳的提取工艺。

表1 响应面分析因素与水平

1.3.7 数据处理 试验数据均以“平均值±标准差”表示。采用Oringin 7.5软件作图，用Design-Expert 8.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 预处理对藠头提取物抑菌活性的影响

藠头采收期短，且储存中容易发芽变质，须进行一定处理以延长其保存期，因此考察不同处理方式及条件对藠头提取物抑菌活性的影响。

由表2可知，新鲜藠头对金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果，经冷藏后，抑菌效果稍有下降，而经冷冻、干燥、盐渍处理后的藠头，完全没有抑菌效果，说明藠头的抑菌成分在冷藏环境下能较好地保存，在冷冻、干燥及盐渍加工处理过程中极易损失，降低了藠头的产品附加值。从新鲜藠头中直接提取抑菌成分加以利用，能更充分发挥其功效，体现其药食两用价值。

表2 预处理方式对藠头提取物抑菌活性的影响

2.2 提取方法对藠头提取物抑菌效果的影响

不同提取方法得到的提取物成分往往有极大差异，采用常见的热水浸提法、乙醇提取法、酶辅助提取法对藠头分别进行提取。由图1可以看出，在相同条件下，藠头的果胶酶辅助提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径最大，为25.36 mm，纤维素酶提取物其次，中性蛋白酶提取物与水提取物相差不大，50%乙醇溶液提取物抑菌作用最弱。这是因为藠头细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶等物质组成，果胶酶和纤维素酶能极大促进其分解，使藠头中的抑菌成分更充分快速溶出，粗提物的抑菌性能也随之提高。藠头的乙醇提取物抑菌作用较弱，可能是由于藠头中含有的蛋白质和多糖与乙醇发生沉淀反应，包裹了一定量的抑菌成分，使其难以溶出［14］；也有可能是抑菌成分在50%乙醇溶液中溶解性差，从而降低了抑菌效果。因此，本试验选择果胶酶辅助法优化提取藠头的金黄色葡萄球菌抑菌成分。

2.3 pH值对果胶酶辅助提取藠头抑菌成分的影响

在选择果胶酶辅助提取的前提下，考察不同pH值对藠头提取物抑菌效果的影响。由图2可知，pH值对藠头提取物抑菌活性的影响十分明显，对金黄色葡萄球菌的抑制效果随着pH值的增加而降低，在pH值为3.0处具有最大抑菌圈直径，其提取物抑菌效果最强。这是因为果胶酶的最适宜pH值为3.0，在此条件下能最大程度发挥其酶活力，且酸性条件有利于破坏藠头组织结构，促进抑菌成分溶出。

2.4 果胶酶添加量对藠头提取物抑菌活性的影响

由图3可以看出，果胶酶的添加量对藠头提取物抑菌作用有明显影响，在一定范围内，提取物抑菌效果随果胶酶添加量的增加而增强，当果胶酶添加量为0.7%时有最大抑菌圈直径，为26.45 mm，当添加量超过0.7%时提取物的抑菌圈直径增幅不大，说明添加少量的果胶酶就可明显提高提取物的抑菌性能，从经济效益方面考虑，最适宜的果胶酶添加量为0.7%。

2.5 提取时间对藠头提取物抑菌活性的影响

由图4可以看出，提取时间对藠头提取物抑菌活性有明显影响，藠头提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径随提取时间的延长而增大，当提取时间达到60 min时，抑菌圈直径最大，继续延长提取时间，浸提液中的抑菌成分则开始降解失活，提取液的抑菌性能随之降低。

2.6 提取温度对藠头提取物抑菌活性的影响

在温度为40、45、50、55、60℃条件下，分别提取藠头抑菌成分，考察温度对提取物抑菌效果的影响。由图5可知，藠头提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径随提取温度的升高而逐渐增大，当提取温度升高至50℃时，抑菌圈直径达到最大值，温度继续升高，提取液的抑菌性能开始下降。这是因为果胶酶的最适宜使用温度为50℃，超过酶的最佳使用温度后，果胶酶因高温失活，无法发挥其辅助效果。

2.7 料液比对藠头提取物抑菌效果的影响

由图6可知，料液比对藠头提取物抑菌效果的影响十分明显，抑菌圈直径随料液比的增大而增大，当料液比为1 g∶4 mL时，增大趋势减缓。料液比过大，溶剂回收时间和成本增加，不利于后续工作进行，因此不宜选择过大料液比。

2.8 响应面试验结果分析

固定提取温度为50℃、果胶酶添加量为0.7%，以pH值、提取时间、料液比为自变量，提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径（y）为响应值，采用Design-Expert8.0软件对试验数据进行响应面回归分析。共设17个试验点，其中12个析因点，5个中心点，每组样品重复3次［15］。响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

经二次回归拟合后求得响应函数，回归方程为y＝24.19-0.87A+1.39B+2.38C+0.4AB-0.11AC-0.71BC-1.62A2-1.97B2+1.72C2。

由表4可知，该回归模型达到极显著水平（P＜0.01），对提取液抑菌影响程度表现为C＞B＞A，即料液比＞提取时间＞pH值，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2和交互项BC对结果影响极显著（P＜0.01）。模型的回归系数（R2）为0.990 3，说明模型拟合度较好。失拟项P＝0.084 7＞0.05，差异不显著，调整决定系数（＝0.977 7）接近l，变异系数（CV）仅为1.67%，表明该模型方程可用来分析和预测不同提取工艺条件下藠头提取物抑菌圈直径的最佳理论值［16］。

表3 响应面试验设计及结果

根据回归方程，作出各因素间交互作用对提取物抑菌性能影响的响应面及等高线。由图7可知，提取时间与料液比之间的交互作用十分显著，表现为曲线较陡，随着数值的增加，响应值变化较大。其他因素间交互作用较小。

表4 响应面试验结果方差分析

Design-Expert8.0分析结果表明，在pH值为3.71，提取时间为62.17 min，料液比为1 g∶5 mL时，可达到提取液对金黄色葡萄球菌的理论最大抑菌圈直径，为（28.47±0.06）mm。为验证响应面分析法所得结果的可靠性，采用理论最佳提取条件进行提取试验，在实际操作过程中将试验因素调整为pH 值为3.7、提取时间为62 min、料液比为1 g∶5 mL，做3次平行试验，实际测得藠头提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为28.42 mm。预测值与实际值相符，证实回归模型可靠。

3 讨论

通过单因素试验，确定藠头抑菌成分提取宜选用果胶酶辅助提取法，且提取温度最佳为50℃、果胶酶添加量达到原料质量的0.7%为宜，再进一步根据响应面分析得出，在果胶酶法提取藠头抑菌成分时，各因素对提取物抑菌性能的影响表现为料液比＞提取时间＞pH值。应用响应面分析法优化提取工艺参数为料液比为1 g∶5 mL、pH值为3.7、提取时间为62 min，在此条件下得到提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为28.42 mm。研究表明，基于响应面法分析所得的优化藠头提取抑菌成分工艺参数准确可靠，具有实用价值。以藠头提取物为原料制备天然抑菌剂还有待进一步研究。