高效液相色谱法测定铋镁碳酸氢钠片中甘草酸含量

李志远，左文松，代明晶

（1.云南省食品药品监督检验研究院，云南 昆明 650106； 2.云南省文山壮族苗族自治州丘北县人民医院，云南 文山 663000）

复方制剂铋镁碳酸氢钠片[1]组方中，甘草流浸膏占比为每1 000片160 g，而现行质量标准中仅收载该成分的鉴别项作为质量控制指标，仅能判断处方中是否含有甘草流浸膏，无法判断厂家在该药品生产过程中是否严格按处方量投料生产；现行标准不能很好地区分不同厂家生产的药品的内在质量。本试验中选择处方中甘草浸膏的有效成分甘草酸为指标成分[2-5]，建立测定其含量的高效液相色谱（HPLC）法[6]，为该药的质量控制提供定量评价方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，包括DGU-20A型脱气机、LC-20AT型溶剂输送泵、SIL-20A型自动进样器、CTO-20A型柱温箱、SPD-20A型紫外-可见检测器，LCSolution化学工作站（日本岛津公司）；FUNGILAB型超声仪（FUNGILAB仪器公司，功率为180 W，频率为 50/60 kHz）；CPA224S/CPA225D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 试药

铋镁碳酸氢钠片（昆明积大制药有限公司，批号分别为130301，130305）；甘草酸铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110731）；乙腈（赛默飞世尔科技有限公司）、甲醇（默克公司）为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；检测波长：237 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

表1 流动相梯度洗脱表（%）

2.2 溶液制备

取甘草酸铵对照品10.00 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，摇匀，作为对照品贮备液。取样品适量，研细，称取0.3 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇适量，超声提取10 min，冷却，加50%甲醇定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按铋镁碳酸氢钠片的处方和工艺制备不含甘草的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2项下3种溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。可见，待测峰与其他峰分离良好，阴性对照品溶液无干扰，理论板数按甘草酸峰计应不低于5 000。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取对照品贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，用 50%甲醇定容至刻度，摇匀，精密吸取20 μL，按2.1项下色谱条件分别进样测定，计算峰面积，记录色谱图，并以甘草酸质量浓度（μg/mL）为横坐标（X）、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=10 498X+4 625.6，R2=0.999 9（n=5）。结果表明，甘草酸质量浓度在20.06～200.60 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取同一供试品溶液20 μL，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果的RSD=0.45%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为130305）适量，依法制备供试品溶液，精密量取20 μL，分别于室温下放置0，2，4，6，8，12，24 h 时进样测定，测定峰面积。结果的RSD为2.00%（n=7），表明室温下供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取样品（批号为130305）适量，每份0.15 g，共6份，精密称定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇适量，超声提取10 min，分别精密加入对照品溶液，加50%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液20 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 甘草酸加样回收试验结果（n=6）

重复性试验：取样品（批号130301）适量，共6份，同法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.56%（n=6），表明方法重复性良好。

耐用性试验：取供试品溶液，其他色谱条件不变，改变流速、改变柱温、改变色谱柱品牌、相同品牌不同长度，按拟订色谱条件分别进样分析，记录色谱图峰面积。结果的RSD为1.09%（n=5），表明方法耐用性好。

2.4 样品含量测定

取2批样品各适量，研细，称取0.15 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇适量，超声提取10 min，冷却，加50%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，用标准曲线法以峰面积计算样品中甘草酸含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n=7）

3 讨论

3.1 前处理条件优化

提取溶剂确定：取样品0.3 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，分别以30%，50%，70%，100%的甲醇溶液作为提取溶剂，按2.1项下色谱条件进样10 μL测定，记录峰面积。结果显示，以50%甲醇溶液作为提取溶剂效果较好。

提取容积确定：称取样品0.3 g，精密称定，分别置25，50，100 mL容量瓶中，以50%甲醇作为提取溶剂，制成不同质量浓度的供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，进样量分别为 5，10，20 μL，测定峰面积。结果显示，提取容积为50 mL时效果较好，故选择此法作为样品的提取方法，并超声10 min。

3.2 色谱条件选择

参考2010年版《中国药典（一部）》甘草含量的测定方法，对该流动相体系、检测波长和供试品溶液的制备方法进行了考察[4]，结果显示，乙腈-0.05%磷酸溶液流动相体系梯度洗脱所得到色谱图基线较平稳，且分离效果好；甘草酸在237 nm波长处有最大吸收。

3.3 供试品溶液处理方法选择

首先，分别采用30%，50%，70%，100%甲醇溶液进行提取试验，结果发现，50%甲醇提取最完全，故以其作为提取溶剂[5]；其次，以不同提取容积对样品进行提取试验，发现以50 mL为提取容积进行提取效果最好。同时选用超声提取方法（50 kHz，180 W，超声时间为10 min）作为供试品溶液的处理方法。

3.4 溶液浓度与对照品选择

本试验中需要配制对照品贮备液，原因在于其浓度较高，且不易改变，而稀释易受环境影响，浓度易变，同时做加样回收试验时每份样品中需加入等量对照品。因此，采用等体积取同一浓度的对照品贮备液的方法可减小其误差[7-8]。本试验中选择甘草酸铵为对照品，在方法学数据采集时均已换算成甘草酸。

综上所述，该方法简便、准确、可靠，可用于铋镁碳酸氢钠片中甘草酸的含量测定。