高效液相色谱法测定3种剂型黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量*

王 谦，赖 慧，陈 立，李 建，米晓琴，赵福兰

（西南医科大学附属中医医院药剂科，四川 泸州 646000）

中药黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge. 或蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch）Bge.Var.mongholicus（Bge.）Hsio的干燥根，主要含皂苷类、氨基酸、多糖等成分。研究表明，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为黄芪的活性指标成分，故2015年版《中国药典（一部）》以黄芪药材中黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量作为其质量评价指标[1]。中药配方颗粒生产中均采用企业自拟标准，至今尚未形成国家统一的质量标准[2-3]。中药最细粉是利用超微粉碎技术将药物粉碎至粒径小于50 μm，使动植物细胞膜破裂，显著提高了有效成分的溶出度及其生物利用率[4]。本研究中采用高效液相色谱法测定黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，以评价黄芪饮片、最细粉和配方颗粒的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪、AUW120D型电子天平（日本岛津公司）；Alltech 3300型蒸发光散射检测器（ELSD，瑞士步琦公司）；BM1926型索氏提取器（成都寰宇鑫成特种玻璃有限公司）。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品（批号为 111920-201203）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号为119348-201432），均购自成都市食品药品检验所；黄芪饮片（四川禾一天然药业有限公司，批号为140901），黄芪配方颗粒（委托四川新绿色药业科技发展股份有限公司加工，每袋1.4 g，相当于黄芪药材10 g），黄芪最细粉（委托泸州百草堂中药饮片有限公司加工），3种剂型均为同一批次黄芪药材制得；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余制剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

黄芪甲苷：色谱柱为Kromasil100-5C18柱（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相为乙腈 -水（32 ∶68，V/V）；柱温为40℃；流速为1.0 mL/min；ELSD检测器流动气体压力为 350 kPa；漂移管温度为 45 ℃[1，5]。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷：色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min时A为20%→40%，20～30 min时A为40%）；检测波长为260 nm；柱温为 40 ℃；流速为 1.0 mL/min[1，6]。

2.2 溶液制备

2.2.1 黄芪甲苷

对照品溶液：称取黄芪甲苷对照品7.64 mg，精密称定，用甲醇定容至10 mL，制备成质量浓度为0.764 g/L的溶液，即得。

黄芪配方颗粒供试品溶液：取黄芪配方颗粒0.56 g，精密称定，置索氏提取器中，加入甲醇40 mL，冷却过夜，加入适量甲醇，加热回流4 h，浓缩至干，残渣加10 mL水，微热使溶解，以水饱和正丁醇40 mL提取4次，合并正丁醇液；氨试液40 mL洗涤2次，弃氨液，蒸干，残渣加水5 mL使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（1.5 cm ×12 cm），加水 50 mL 洗脱，去水，40% 乙醇30 mL洗脱，去洗脱液，加80 mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，甲醇溶解，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

黄芪最细粉供试品溶液：取黄芪最细粉4 g，精密称定，加水10 mL，微热使溶解，其余同配方颗粒供试品溶液项下方法制备。

黄芪饮片供试品溶液：同黄芪最细粉供试品溶液项下方法制备。

2.2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷

对照品溶液：称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品4.35 mg，精密称定，用甲醇定容至10 mL，制备成质量浓度为0.435 g/L的对照品溶液。

黄芪配方颗粒供试品溶液：取黄芪配方颗粒0.14 g，置圆底烧瓶中，加甲醇50 mL，称定质量，加热回流4 h，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL，回收溶剂，浓缩至干，甲醇溶解残渣，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

黄芪最细粉供试品溶液：取黄芪最细粉1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，其余同黄芪配方颗粒供试品溶液项下方法制备。

黄芪饮片供试品溶液：同黄芪最细粉供试品溶液项下方法制备。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取上述对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，结果黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的理论板数均大于3 000，分离良好。在此条件下的色谱图见图1。

线性关系考察：分别吸取2种对照品溶液各2.5，5.0，10.0，15.0，20.0μL，按 2.1 项下色谱条件进样分析。以峰面积（A）对数值为纵坐标（Y）、对照品进样量（μg）对数值为横坐标（X）进行线性回归，得黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程分别为Y黄=1.522X黄+11.310（r=0.998 0，n=5），Y毛=3.57×106X毛+11 728（r=0.9990，n=5）。结果表明，黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量分别在 1.91～15.28 μg和 1.09～8.70 μg范围内时，其对数值与峰面积对数值线性关系良好。

精密度试验：精密吸取黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液各10 μL，在2.1项下色谱条件进样测定，分别重复进样6次，测定各自峰面积。结果的RSD分别为1.56%和1.34%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：室温下精密量取3种供试品溶液各10 μL，室温下分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样，测定黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积。结果的RSD均小于3%（n=6），表明室温下供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：称取3种样品，精密称定，同法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，共6份，分别测定黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积。结果的RSD均小于2%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知黄芪甲苷含量为0.086%的同一配方颗粒6份，每份1 g，加入黄芪甲苷对照品0.5 mg，依法制备供试品溶液，进样检测。取已知毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为0.073%的同一配方颗粒6份，每份1 g，加入毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品0.5 mg，依法制备供试品溶液，同法测定。结果见表1和表2。

表1 黄芪甲苷加样回收试验结果（n=6）

表2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取黄芪不同剂型样品各6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果黄芪饮片、黄芪配方颗粒、黄芪最细粉中黄芪甲苷的平均含量分别为（0.074 6±0.003 5）%，（0.056±0.004 5）%，（0.129 ±0.005 1）%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均含量分别为（0.031±0.002 1）%，（0.022±0.002 4）%，（0.025±0.001 9）%。

3 讨论

中药超微粉碎与传统中药打粉均为粉碎加工，但也不完全相同。中药材传统打粉的粒度一般为100 μm，而中药微粉粒度可到几微米甚至更小[6-7]。在此粒度下，植物细胞壁破碎产生的效应，以及颗粒的比表面积、表面活性、分散性等都起了综合变化[8]。本研究结果显示，黄芪最细粉中黄芪甲苷的含量远高于黄芪饮片中的含量，可能是因为黄芪打成最细粉后，其细胞壁被破坏，有效成分更易溶出。

中药配方颗粒仍有值得深究的地方。从临床用药情况看，中药配方颗粒的药效与中药饮片的药效并无显著差异，但配方颗粒是单味中药的提取[9-10]，省去了药物间共同加热、缺少了药物间相互作用的过程，然而每味中药所含成分有几十种甚至几千种，这些成分可能是药方中的有效成分，但换到其他药方中，就无法起到应有的作用[11-13]。

本研究旨在比较不同剂型黄芪的质量差异，结果显示，3种剂型黄芪中黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均符合2015年版《中国药典（一部）》规定，即黄芪饮片中含黄芪甲苷不得少于0.040%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷不得少于0.020%。其中最细粉中黄芪甲苷含量最高，而3种剂型黄芪的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量差异不大，可能是因为毛蕊异黄酮葡萄糖苷暴露在空气中易氧化，所以饮片中含量最高，配方颗粒和最细粉与空气接触面积增大，氧化率高，故较饮片含量略低，但无明显差异，且含量均超药典标准，不影响临床使用。另外，《中国药典》并未收载黄芪打粉使用的炮制方法，通过本试验可知，中药黄芪适合打粉使用[14]，同时本研究也为《四川省中药饮片炮制规范》（2015版）[15]新增黄芪炮制方法即粉碎成细粉使用提供了理论依据。