氧化应激因素在干眼中的实验研究

林 启，吴康瑞，邵 毅

0引言

干眼是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称。主要的病理生理机制为泪膜不稳定、泪液渗透性升高、眼表炎症与损伤及神经感觉异常[1]。以往临床和实验室研究发现，干眼是一种多因素慢性炎症性疾病，由外在或内在因素导致泪膜不稳定和高渗。在某些情况下泪液成分的这些变化会与全身因素相结合，导致炎症循环，引起眼表上皮异常和神经刺激[2]。衰老是干眼重要的危险因素之一[3]，流行病学调查研究表明，干眼的患病率随年龄增长而增加[4]，而氧化应激是年龄相关性干眼的重要危险因素之一[5]，同时又与炎症途径的激活有关[6]。有研究支持铜锌超氧化物歧化酶家族(Cu、Zn SOD家族)是主要的抗氧化系统，而缺乏SOD-1的小鼠将加速衰老[7]。还有研究发现老年大鼠角膜上皮化生和胞质脂褐素样物质沉积增多，并伴随抗氧化标记物维生素E的含量下降[8]。而限制热量的饮食可以防止许多器官因营养不良而导致的功能衰退[9]。本文将对氧化应激因素在干眼中的实验研究进行综述。

1与氧化应激有关的干眼的病理生理学机制

1.1活性氧与干眼氧化应激因素对干眼的影响可用干眼周期来描述[10]。这个系统的核心因素是活性氧(reactive oxygen species，ROS)，当ROS水平增加时，各种抗氧化酶水平上调，可能产生负反馈以调节应激信号的强度或降低ROS水平。正常情况下抗氧化防御系统维持ROS于低水平，应激信号强度正常。各种外界因素如紫外线、污染物、药物和年龄等都可引起ROS水平升高。不可控制的ROS的升高可直接损伤泪液脂质层等结构以及眼表神经的髓鞘，导致干眼的发生。因此，抗氧化防御对于保持活性氧水平低于诱导过度应激信号阈值的水平至关重要。ROS是干眼良好的监测指标，可以反映干眼的病程和治疗效果。监测过程中可以发现ROS水平随年龄升高增加并伴随氧化酶和抗氧化酶水平的降低。也可通过降低ROS水平而不必着重纠正干眼周期的其他问题来治疗干眼。

1.2高渗泪液和眼表炎症与干眼泪液是眼表面上皮细胞的细胞外液，含水泪液流量减少或含水泪液蒸发增加将导致泪液高渗透压，这是干眼进入恶性循环的关键步骤。泪液高渗透压引起形态学变化，例如结膜和角膜细胞的凋亡，并引发导致进一步细胞死亡的炎症级联，包括产生粘蛋白的杯状细胞的丧失。慢性炎症最终会降低特定的泪液成分，加剧了泪膜的不稳定性，使干眼恶性循环并长期存在[11]。

2氧化应激与干眼相关的实验证据

2.1体外实验证明氧化应激与干眼有关的证据主要基于体外实验和动物实验。在体外实验中，以高渗培养基的形式模拟人角膜上皮细胞氧化应激的环境，进行人角膜上皮细胞原代培养。实验中可观察到年龄相关的ROS生成增加并伴随氧化酶和抗氧化酶水平的降低，线粒体DNA损伤以及膜脂质过氧化中氧化标记物显示的膜损伤[12]。

2.2动物实验

2.2.1 SOD1基因敲除小鼠实验一项Sod1(-/-)小鼠的研究指出了氧化应激与干眼之间的关系。该研究显示在Sod1(-/-)小鼠与野生型小鼠相比泪腺和睑板腺(meibomian gland，MG)中存在组织病理学、功能性和炎性年龄依赖性变化。首先自由基生成和清除抗氧化系统之间的不平衡导致了氧化应激，这与许多年龄相关疾病中观察到的细胞损伤情况一致。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)家族是一种主要的抗氧化系统，Cu、Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)在小鼠体内的缺乏导致了许多类似于加速老化的表型。在这项研究中，我们检查了Sod1(-/-)小鼠泪腺的形态特征和分泌功能。泪腺的光镜检查显示腺泡单位萎缩、纤维化， CD4(+)T细胞、单核细胞和中性粒细胞浸润；电子显微镜检查结果揭示了上皮-间质细胞化生，肿胀和退化线粒体，并且在衰老的Sod1(-/-)小鼠的泪腺中存在凋亡细胞[7]。另外还观察到了睑板腺功能障碍(meibomian gland dysfunction，MGD)[13]，MGD是加剧干眼的主要原因，造成腺体减少导致泪膜脂质减少，泪液水分蒸发增加，泪膜渗透压增加进而形成眼表面的变化，如泪膜不稳定和睑缘炎[14]。

2.2.2转基因小鼠模型实验氧化损伤和炎症被认为与外分泌腺的年龄相关功能衰退有关。然而，氧化应激如何影响外分泌腺分泌功能的分子机制尚不清楚。在一种新型mev-1条件转基因小鼠模型(Tet-mev-1)中，发现泪腺线粒体氧化损伤导致泪腺功能障碍，泪液生成减少，ROS生成增加，进而导致干眼的发生。mev-1基因编码Cyt-1是线粒体复合物Ⅱ中琥珀酸-泛醌氧化还原酶的细胞色素b 560大亚基，与人体中的琥珀酸脱氢酶C亚基(SDHC)同源。该mev-1基因诱导过度氧化应激，与眼表上皮损伤、泪液蛋白和泪液分泌功能下降有关。Tet-mev-1小鼠泪液量低于野生型小鼠，组织病理学分析显示泪腺炎症主要表现为泪腺单个核白细胞浸润和泪腺纤维化。这些发现表明，氧化应激可能是干眼发展的致病因素[15]。

2.2.3糖尿病干眼小鼠模型实验涉及糖尿病诱导干眼的小鼠研究也支持氧化应激与干眼之间的联系。SIRT1是一个与延长寿命，DNA损伤，代谢应激，炎症和癌症相关的关键调节因子[16]，并且与ROS生成有关，是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的脱乙酰基酶[17]。而ROS的释放和氧化应激的产生被认为是糖尿病发病机制的关键因素[18]，实验表明糖尿病的诱导产生与SIRT1和另一种抗氧化剂SOD的表达增加有关，这个过程会持续4wk，并在随后8wk内表达降低[19]。实验将干眼组中的每只小鼠每天3次注射氢溴酸东莨菪碱，并结合低湿度环境以建立干眼模型，结果显示泪液生成明显减少，角膜荧光素染色增加，且与抗氧化功能的时间变化有关。随着疾病的进展，所有实验组均显示HE染色明显的病理改变[19]。这些实验结果有力地说明了干眼确实与氧化改变有关。

2.2.4限制大鼠饮食模型实验及其他实验泪腺分泌功能的降低与衰老密切相关，并导致干眼的患病率增加。由于热量限制(calorie restriction, CR)被认为可以防止由于衰老引起的各种器官的功能衰退，故限制大鼠热量摄入可作为抗氧化应激的一种干预。限制热量饮食6mo后，在有意识状态下大鼠检查泪液功能，结果发现实验组大鼠泪腺功能优于非限热量对照组。用卡巴胆碱进行泪液蛋白分泌刺激实验，并用8-羟基-2 脱氧鸟苷(8-hydroxyl-2 deoxyguanosine, 8-OHdG)和4-羟基壬烯醛(hydroxynonenal, HNE)评估氧化应激。与对照组相比，实验组泪液体积明显改善并且在卡巴胆碱刺激后泪液蛋白分泌量增加，腺泡单位密度显着提高，表现出较小程度的间质纤维化，且泪腺中8-OHdG的浓度和HNE染色的程度降低[20]。这些结果证明了CR可以减轻泪腺中与氧化应激相关的损伤。在另一种大鼠模型中,将大鼠连续暴露于低湿度气流中30d，氧化应激标记物(8-OhdG，HNE)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)的免疫反应增强，荧光素染色增加，这是干眼的临床特征[21]。在衰老大鼠中，有证据表明泪腺分泌眼泪所需的关键转运蛋白的改变会导致干眼：rab3d mRNA和rab27b mRNA的表达和rab3d蛋白的表达降低，而突触融合蛋白水平增加[22]。

3干眼与氧化应激的介入实验研究

3.1减少ROS的物质研究表明，某些物质能够降低ROS水平。在过氧化氢诱导氧化应激下培养的角膜上皮细胞中，用乳铁蛋白和黄原胶培育可以保护细胞免受ROS的有害影响[23-24]，黄原胶还能降低细胞内ROS水平[24]。另外在活细胞中，某些抗氧化酶的水平可能在对ROS威胁的直接反应中受到严格调控。在蓝莓提取物中所发现的左旋肉碱和紫檀芪，均能降低氧化损伤生物标志物和炎症介质的水平，同时降低抗氧化酶的水平[25-26]。

3.2减轻氧化应激损伤的物质对小鼠和大鼠疾病模型的临床前干预研究表明氧化应激造成的损伤可以被有效降低。在一项用抗氧化药用植物提取物对干眼小鼠进行的研究中，未经过给药的对照组小鼠泪腺组织中不仅存在氧化损伤，而且有眼表炎症的证据：泪液白细胞介素(IL-1b、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-c)及其相关趋化因子、CD4 c-x-c趋化因子受体(Cr3t)细胞)均有升高。其临床特点包括泪液产生及泪膜破裂时间(breakup time of tear, BUT)的减少，角膜荧光素染色增加，产生粘液的杯状细胞密度降低。这些特征在实验组通过治疗均得到了改善[27]。另外，干眼在绝经后妇女中很普遍，因为更年期期间激素水平的变化会影响睑板腺功能，导致蒸发性干眼和泪液不稳定，高渗性和促红细胞生成素的产生。在绝经后干眼大鼠模型中，治疗组大鼠用α-硫辛酸(α-lipoic acid，ALP)给药，结果发现泪道功能恢复，Schirmer试验改善。α-硫辛酸是一种内源性合成的线粒体酶复合物的辅助因子，其生物学效应包括ROS的吸收、促进如维生素C和维生素E等其他抗氧化剂的相互作用和再生，以及氧化还原过程的调节。α-硫辛酸改变了活性氮物质的代谢，导致泪腺过氧化物酶活性增加和泪液生成改善[28]。这些研究表明有许多物质能够减少氧化应激的损害，改善干眼状。

4总结与展望

通过实验室研究证实，氧化应激因素与干眼具有密不可分的联系。眼表氧化应激的研究尚处于起步阶段，极有可能将实验研究成果应用于临床。氧化应激为干眼的治疗提供了新依据，未来研究的潜在领域包括眼部抗氧化治疗的途径。今后几年，对眼表面氧化应激的研究可能会产生越来越大的影响。因此，眼科从业者应该意识到氧化应激在干眼中的作用。