外泌体在骨肉瘤诊断与治疗中的应用进展

罗雄 张春林

外泌体是在生理或病理状态下由细胞分泌的一种具有脂质双分子层膜结构的囊泡，含有蛋白质、双链DNA(dsDNA)、RNA等多种组分。外泌体可将生物信号传递至受体细胞，导致对应细胞功能变化[1-2]。近年多项研究表明，外泌体与恶性肿瘤的发生、迁移、耐药、血管新生及免疫调节等诸多方面均有密切联系。骨肉瘤为起源于骨间叶细胞的恶性原发骨肿瘤，约占原发骨肿瘤的15%。典型骨肿瘤一般好发于长骨，血行转移发生早，发生率高且进展迅速。近10年来结合新辅助化疗与外科手术，骨肉瘤5年总体生存率提升至65%～70%，但进一步提升其治疗效果仍然面临诸多困难[3-5]。

1 外泌体的生物学特点

外泌体是1986年在绵羊红细胞体外培养物的上清液中发现的一种小型囊泡样物质[6]，其结构为直径30～150 nm的双层脂质包裹体，一般呈球形或扁盘状，通常在蔗糖密度梯度溶液中获得富集[1，7]。外泌体可由绝大多数细胞通过类胞吞胞吐模式分泌至血液等体液中，其主要内容物包括腺苷三磷酸酶(ATPase)和磷酸甘油酸激酶(pgk1)等酶类、mRNA、DNA、微小RNA(miRNA)、转录因子、黏附因子、热休克蛋白、细胞骨架蛋白、脂质筏、膜转运蛋白、四分子交联体家族成员、受体及病毒[8]。外泌体的大小、数量、理化性质、表面分子标志物及部分内容物种类和数量均受细胞外微环境的调节，如三维结构、氧含量、酸碱度和硬度等[9-10]。目前，提取和纯化外泌体主要依据其理化特性，具体方法包括超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、超滤法、聚乙二醇沉淀法、色谱法、免疫磁珠法及试剂盒提取法(Exo Quick)等[11-12]。

2 外泌体与免疫疗法

由T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等分泌的外泌体具有免疫刺激或免疫调节作用，可参与抗原提呈、T细胞活化、T细胞极化为调节性T细胞、免疫抑制和抗击炎症等过程[13-14]。Lagerweij 等[15]通过研究小鼠肿瘤源性外泌体介导的骨肉瘤细胞与间充质干细胞的相互作用发现，与肿瘤源性外泌体共培养的间充质干细胞可促进肿瘤生长和迁移，并参与肿瘤预转移龛形成，这可能与外泌体介导的免疫逃逸机制相关。Troyer等[16]通过比较骨肉瘤细胞与成骨细胞来源的外泌体中的内含蛋白发现，二者成分及作用均有显著差别。在抑制T细胞增生、调节T细胞表型方面，骨肉瘤细胞来源的外泌体作用更明显。因来源不同，肿瘤细胞来源的外泌体(TDE)可刺激免疫细胞功能或抑制肿瘤免疫反应[17]，而负载肿瘤抗原的树突状细胞分泌的外泌体(DEX)可诱导小鼠肿瘤生长抑制反应[18]，但TDE 和DEX诱导的抗肿瘤免疫反应相对较弱，且易产生免疫耐受[19]。Lässer[18]通过体内和体外研究发现，免疫佐剂多鸟嘌呤胞嘧啶和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可通过对T细胞和B细胞的作用显著增强机体的抗肿瘤免疫反应。Morishita 等[20]提出，基于外泌体肿瘤抗原-佐剂共递送系统的肿瘤免疫疗法可能成为肿瘤治疗的新方向，但其在骨肉瘤中的有效性有待进一步验证。

3 外泌体与液体活检

间叶组织来源的骨肉瘤不仅肿瘤异质性明显而且缺乏经典的肿瘤标志物，故传统检测手段倍受制约。体液中的TDE既可在体内稳定存在，又可在体外-80 ℃条件下妥善保存，同时包含随肿瘤生理机能变化而变化的具有肿瘤异质性的丰富内容物[21]，故其作为新型的骨肉瘤诊断及预后监测工具潜力极大。Brady等[22]通过对不同分期骨肉瘤患者和健康志愿者血清中外泌体的内含蛋白进行分析发现，10余种蛋白在鉴别骨肉瘤患者与健康志愿者方面准确率为85%。进一步研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白D1和主要组织相容性复合体Ⅲ类补体成分C6在鉴别方面的准确率均较高，并可提示骨肉瘤分期。Jerez等[23]对骨肉瘤细胞系MG63、Saos2和U2OS进行蛋白组学分析发现，存在明显差别的部分外泌体内含蛋白与肿瘤发生发展中的血管生成、细胞黏附和细胞迁移密切相关。Yoshida等[24]通过对236例血清miRNA样本分析发现，外泌体中miR-25-3p的含量在骨肉瘤患者和健康者之间存在明显差异。骨肉瘤来源的外泌体中miR-25-3p过量表达可促进人脐静脉内皮细胞的侵袭和迁移，并参与肿瘤微环境的调控，促进肿瘤发展。Endo-Munoz等[25]发现，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)在转移型骨肉瘤细胞系(KHOS、KPIB、143B)的表达水平明显高于非转移型骨肉瘤细胞系(HOS、MG63、G292)，表明在骨肉瘤表型转化和骨肉瘤肺转移过程中，uPA/uPA受体可通过外泌体介导的旁分泌和自分泌发挥重要作用。

值得注意的是，Miller等[26]首次在尤文肉瘤细胞系中证明了外泌体的存在，并在肿瘤来源的外泌体中检测到特异融合基因EWS-FLI1的表达。

4 外泌体与多药耐药

骨肉瘤目前主要的治疗方法为新辅助化疗结合外科手术。随着新型化疗药物的使用，近20年来骨肉瘤5年生存率从不足20%提升至65%～75%，但仍有超过30%的患者经历高强度化疗后疗效不尽如人意，而多药耐药(MDR)是造成骨肉瘤化疗失败的重要原因[27]。Torreggiani等[28]发现，阿霉素耐药骨肉瘤细胞(MG63)释放的外泌体可被转运至非耐药细胞，并诱导后者产生阿霉素耐药表型，这一现象可能与MDR-1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycoprotein)的转运相关，Shedden等[29]利用荧光标记抗肿瘤药物发现外泌体可将其由胞内排除至胞外，在一定程度上解释了肿瘤化疗的耐药性。Xu等[30]通过对746种miRNA的筛选，发现骨肉瘤低化疗敏感性患者的血清外泌体中有12种miRNA(miR-135b、miR-148a、miR-27a及 miR-9等)明显上调和18种miRNA(miR-124、miR-133a、miR-199a-3p及miR-385等)明显下调，可能的机制涉及肿瘤蛋白多糖代谢、Hippo信号转导通路、转录失调、磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号转导通路、Ras信号转导通路、泛素介导的蛋白水解及胆碱代谢等。膜联蛋白(Annexin2)、Smad2、甲硫腺苷磷酸化酶、骨架调节蛋白CIP4、色素上皮衍生因子、氧化还原酶、细胞分裂周期5蛋白(Cdc5L)、细胞周期激酶抑制剂P27等相关mRNA异常表达同样也与患者低化疗敏感性密切相关。随着外泌体参与MDR机制的逐渐阐明，外泌体检测将成为预测和监测骨肉瘤患者化疗效果的重要参考依据，同时利用外泌体增强患者对化疗药物的敏感性可能为骨肉瘤化疗带来新的机遇。

5 外泌体与药物递送载体

一方面外泌体具有和来源细胞的细胞膜组分相近并可直接融合靶细胞的外膜，另一方面外泌体可选择性包裹细胞组分并在体液中自由移动投递至靶细胞，因此外泌体可作为基因药物[miRNA、小干扰RNA(siRNA)、mRNA等][31]、抗癌药物(紫杉醇和阿霉素等)[32-33]、抗炎症药物及增强免疫的抗原和蛋白药物等的载体，其治疗恶性肿瘤的效果受到广泛关注[34-35]。Shimbo等[36]发现，通过外泌体投递至骨肉瘤细胞的miR-143可以抑制肿瘤细胞迁移，虽然投递效率并不尽如人意，但其潜力依旧巨大。Wang等[37]发现，肿瘤相关成纤维细胞所分泌外泌体中包含miR-1228，其通过靶向作用于癌细胞侵袭蛋白抑制因子促进骨肉瘤侵袭和转移。Gong等[38]发现，骨肉瘤转移患者外泌体中存在高表达的miR-675，其可以靶向下调受体细胞CALN1并促进肿瘤侵袭和迁移。Qi等[39]通过将骨肉瘤细胞(MG63)与人骨髓间充质干细胞来源的外泌体共培养，发现后者可通过激活受体肿瘤细胞Hedgehog信号转导通路促进肿瘤细胞生长和迁移。Mu等[40]利用荷瘤小鼠分别在组织和细胞层面观察骨肉瘤发展过程中的骨骼肌萎缩现象，并将骨肉瘤细胞系(K7M2)与肌源性干细胞(MDSC)体外共培养，发现骨肉瘤来源的外泌体可以通过活化Notch信号转导通路抑制MDSC的成肌作用。 随着外泌体参与物质或信息传递具体机制的进一步阐明，阻断或利用相关信号转导通路达成药物靶向作用于骨肉瘤细胞，可能会为临床治疗提供新的选择。目前，一期临床试验结果已证实利用外泌体治疗的有效性，但对于临床应用仍有待进一步研究，如何提高提纯效率、增强靶向性以及转载过程中保存外泌体的完整性是亟需解决的问题。

6 结语

外泌体为人们研究机体的生理、病理过程提供了新的着眼点。随着人们对外泌体信息传递功能的不断重视及各项高灵敏度、高通量和高内涵的分析手段的日趋成熟，外泌体相关研究已进入新阶段，临床应用更是研究热点。多项研究结果表明，外泌体既可调节恶性肿瘤细胞的增殖和凋亡，又可影响肿瘤细胞生长的微环境，进而影响恶性肿瘤的发生、发展、转移、免疫逃逸及化疗耐药性等。在骨肉瘤领域，受限于肿瘤组织特点和样本数量等因素，外泌体相关研究较为滞后，应用外泌体的临床研究有待进一步开展。但随着相关研究的不断深入，其临床应用前景依然广阔，可为骨肉瘤的早期发现和治疗提供新思路与新方法，为骨肉瘤患者及其家庭带来新希望。