沉默survivin表达对甲状腺癌细胞凋亡的影响及其机制研究

余江涛，孙德利

郑州人民医院普外科，郑州 4500030

甲状腺癌是一种发病率在头颈部肿瘤和内分泌腺肿瘤中居首位的恶性肿瘤。2015年中国肿瘤数据显示，甲状腺癌已成为中国中青年女性中最常见的恶性肿瘤之一[1]。近年来，甲状腺癌的发病率和病死率有明显的上升趋势，严重威胁着人们的生活和身体健康。甲状腺癌的发病机制十分复杂，受到癌基因和抑癌基因等多种调控机制的共同作用。寻找有效调控甲状腺癌细胞增殖和凋亡的作用靶点一直是研究的热点。肿瘤的发生发展不仅与细胞恶性增殖有关，也与细胞的凋亡异常密切相关。存活蛋白（survivin）是一种在细胞凋亡过程中发挥重要作用的凋亡抑制蛋白，大量研究表明，survivin在肺癌、乳腺癌和大肠腺癌多种肿瘤组织中呈高表达，与多种肿瘤的形成和发展密切相关[2-4]。研究提示，干扰survivin表达可抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡[5-6]，但目前关于survivin对甲状腺癌细胞凋亡影响的研究较少。本研究通过观察survivin在甲状腺癌组织和细胞中的表达，采用RNA干扰技术调控其表达后，探讨survivin对甲状腺癌细胞凋亡的影响，以期为甲状腺癌的分子机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取郑州人民医院2014年9月至2017年3月收治的98例甲状腺癌切除患者的甲状腺癌组织标本及其相应的癌旁组织标本，所有组织标本均经术后病理检查证实，收集的标本均储存于液氮罐中。98例甲状腺癌患者中，男性32例，女性66例，年龄25～68岁，平均（42.62±12.25）岁。人甲状腺癌细胞株SW579和正常甲状腺细胞株Nthy-ori3-1均购自中国科学院典藏细胞库。

1.2 主要试剂和仪器

根据Genebank中survivin特异性DNA序列采用Primer premier 5.0软件设计survivinsiRNA，正义序列：5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAAdTdT-3'；反义序列：5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGCdTdT-3'。以与所有基因均无同源性序列的non-target siRNA作为阴性对照序列。survivinsiRNA和non-target siRNA均由上海吉玛公司合成。RPMI1640培养液、胎牛血清、青链霉素双抗和Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司，膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin VFITC/PI）凋亡试剂盒、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显色液、放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒均购自南京凯基公司，兔抗人survivin多克隆抗体、鼠抗人β肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、兔抗人B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）单克隆抗体、兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase 3）多克隆抗体和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗鼠或抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulinG，IgG）-HRP二抗均购自美国Santancruz公司，流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.3 免疫印迹法（Western blot）检测甲状腺组织中survivin的表达

取收集的甲状腺癌组织和癌旁组织，置于加有液氮的研钵中迅速研磨至粉末，在冰上充分裂解后，离心，获得上清液。采用BCA蛋白检测试剂盒检测总蛋白的浓度。取变性蛋白50 μg，上样至浓度为10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。待电泳结束后，电转印到聚偏二氟乙烯膜上，经浓度为5%的脱脂奶粉4℃下封闭2 h后，加入均以1∶500稀释的survivin多克隆抗体和β-actin单克隆抗体，于4℃孵育过夜，次日洗膜后加入1∶1000稀释的IgG-HRP二抗，室温孵育2 h，以ECL显色液显影，自动凝胶成像系统采集图像。以β-actin作为内参，分析survivin的相对表达水平。设置重复实验，所有样本均进行Western blot，最后取蛋白相对表达量的平均值。

1.4 培养及转染SW579细胞

将甲状腺癌SW579细胞和正常甲状腺Nthyori3-1细胞培养在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基上，置于设定条件为37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养。待细胞融合度达到80%以上时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。收集对数生长期的SW579细胞和Nthy-ori3-1细胞，采用1.3中的方法检测两种细胞中survivin的相对表达情况，其中每组实验均重复3次。

收集对数生长期的SW579细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，以每孔2 ml接种至96孔细胞培养板上，培养过夜。将培养的细胞随机分为干扰组、阴性组和对照组。根据Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒的转染条件和方法将干扰组和阴性组中的细胞分别以survivinsiRNA和non-target siRNA进行转染，对照组中的细胞不做任何处理。所有细胞置于CO2培养箱中培养4 h后，更换为新鲜的细胞培养液继续培养48 h。为了检测其转染效果，收集转染48 h的各组细胞，Western blot法检测各组细胞中survivin的相对表达水平，步骤同1.3。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

取转染后的上述3组对数生长期的细胞，以RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×103/ml，经离心、固定和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤后，使用 500 μl结合缓冲液重悬细胞，再分别加入Annexin V-FITC 5 μl、PI10 μl，避光反应15 min，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。每组均设3次平行实验。

1.6 Western blot检测各组细胞中蛋白表达情况

为了进一步探讨survivin在甲状腺癌细胞中的作用机制，取转染48 h的各组细胞，加入RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，以BCA法检测总蛋白的浓度，再按照1.3中的步骤进行操作，分别检测各组细胞中cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白的相对表达情况。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0统计-软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 survivin在甲状腺癌组织及癌旁组织中表达情况的比较

Western blot检测survivin在甲状腺癌组织及癌旁组织中的蛋白表达情况，甲状腺癌组织中survivin蛋白相对表达量为（2.55±0.72），明显高于癌旁组织中的（0.62±0.25），差异有统计学意义（t=25.068，P＜0.01）。（图1）

图1 Western blot检测survivin在甲状腺癌组织（n=98）及癌旁组织（n=98）中的表达情况

2.2 survivin在甲状腺癌细胞中的表达情况及转染效果

Western blot检测survivin在甲状腺癌SW579细胞和正常甲状腺Nthy-ori3-1细胞中的相对表达量分别为（0.64±0.07）和（0.13±0.02），SW579细胞中survivin的相对表达量明显高于Nthy-ori3-1细胞，差异有统计学意义（t=12.134，P＜0.01）（图2）。脂质体转染干扰survivin在SW579细胞中的表达，对照组、阴性组和干扰组细胞中survivin相对表达量分别为（0.72±0.12）、（0.68±0.11）和（0.16±0.05），3组survivin相对表达量比较，差异有统计学意义（F=30.290，P=0.001）；对照组与阴性组细胞中survivin相对表达量比较，差异无统计学意义（t=0.426，P=0.692）；干扰组细胞中survivin相对表达量明显低于对照组，差异有统计学意义（t=7.461，P=0.002）（图3）。

图2 Western blot检测survivin在SW579和Nthy-ori3-1细胞中的表达情况

图3 Western blot检测survivin在对照组、阴性组、干扰组细胞中的表达情况

2.3 沉默survivin表达对甲状腺癌细胞凋亡率的影响

沉默survivin表达后，流式细胞仪检测对照组、阴性组和干扰组细胞的凋亡率分别为（12.65±1.52）%、（11.86±1.75）%、（42.38±3.42）%，3 组凋亡率比较，差异有统计学意义（F=159.582，P＜0.01）；对照组与阴性组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（t=0.590，P=0.587）；干扰组细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义（t=13.759，P＜0.01）。（图4）

图4 流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率

2.4 沉默survivin表达对cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白表达的影响

为了进一步探讨沉默survivin表达促进SW579细胞凋亡的作用机制，Western blot检测各组细胞中cleaved caspase 3和Bcl-2的表达情况。干扰组细胞中cleaved caspase 3蛋白相对表达量明显高于对照组，Bcl-2蛋白相对表达量明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；阴性组和对照组cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（图5、表1）

图5 Western blot检测cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白的表达情况

表1 对照组、阴性组、干扰组细胞中cle-aved caspase 3和Bcl-2蛋白相对表达量的比较（±s）

表1 对照组、阴性组、干扰组细胞中cle-aved caspase 3和Bcl-2蛋白相对表达量的比较（±s）

注：*与干扰组比较，P＜0.01

组别对照组阴性组干扰组F值P值cleaved caspase 3 0.26±0.05*0.32±0.06*1.15±0.24 34.959 0.001 Bcl-2 0.86±0.15*0.78±0.22*0.18±0.06 16.687 0.004

3 讨论

survivin是凋亡抑制蛋白家族中最简单但功能最强的凋亡抑制基因，位于人17q25染色体上，由3个内显子和4个外显子构成，可编码142个氨基酸。survivin基因通过上调血管内皮生长因子表达水平促进血管生成，调控线粒体通路或死亡受体通路抑制细胞凋亡，以及间接抑制纺锤体的水解参与细胞周期的调控等作用机制，在甲状腺癌等多种疾病的形成和进展中发挥着重要作用[7-8]。越来越多的研究发现，survivin作为肿瘤治疗的一个优先目标或分子靶点在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要作用[9-10]。甲状腺癌发生和发展的作用机制目前尚不明确，随着近年来甲状腺癌的发展趋势，研究survivin在甲状腺癌中的作用机制，为寻找新的有效诊断和治疗甲状腺癌的方法提供理论意义。有研究发现，采用小干扰RNA干扰survivin在鼻咽癌和宫颈癌中的表达后，可明显促进细胞的凋亡[11-12]。为了探讨survivin在甲状腺癌中的作用机制，本研究首先观察了甲状腺癌组织和细胞中survivin的表达情况，结果发现，survivin在甲状腺癌组织和细胞中均呈高表达。提示，survivin在甲状腺癌细胞的凋亡过程中可能发挥着重要作用。采用RNA干扰技术下调其表达后，流式细胞仪检测甲状腺癌SW579细胞的凋亡情况，结果显示，沉默survivin表达的细胞凋亡率明显升高。提示，沉默survivin表达可抑制甲状腺癌细胞凋亡。

细胞凋亡是一种维持机体正常生长发育的生理性死亡过程，细胞凋亡的紊乱是多种疾病形成和发展的诱导因素。细胞凋亡是一个受多基因和蛋白共同调控的复杂过程。caspase家族是一类在细胞凋亡和分化过程中起重要作用的功能性蛋白酶，caspase 3作为caspase家族中重要的细胞凋亡执行蛋白，处在caspase级联反应的下游，在促进细胞的凋亡过程中发挥重要作用。Bcl家族在细胞凋亡的主要内在途径——线粒体途径中发挥着重要作用，Bcl-2作为Bcl家族蛋白中重要的抗凋亡蛋白，在抑制细胞凋亡延长细胞寿命方面起着关键的调控作用。caspase 3和Bcl-2在甲状腺癌肿瘤组织中异常表达，与甲状腺癌细胞凋亡密切相关[13-14]。大量学者认为，survivin与caspase 3的表达呈负相关，与Bcl-2表达呈正相关。王传艳等[15]和Gu等[16]在探讨survivin和caspase 3在食管鳞癌和前列腺癌中的表达研究中指出，survivin的表达与caspase 3的表达呈负相关。齐志勇等[17]及Zhou和Wang[18]在研究survivin和Bcl-2在喉癌和宫颈癌中的表达发现，survivin的阳性表达率与Bcl-2的阳性表达率呈正相关。丁亦含等[19]通过survivin抑制剂抑制survivin基因表达后，白血病K562细胞中caspase 3的表达水平升高，Bcl-2表达水平下降。为了探讨沉默survivin表达促进甲状腺癌细胞凋亡的作用机制，本研究采用Western blot检测干扰survivin表达后，SW579细胞中cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白的表达情况。结果发现，干扰survivin表达后，cleaved caspase 3蛋白相对表达量明显升高，Bcl-2蛋白相对表达量明显降低。结果提示，沉默survivin表达可通过上调cleaved caspase 3和下调Bcl-2蛋白的表达引起甲状腺癌SW579细胞凋亡。

综上所述，survivin在甲状腺癌的发生发展中具有重要作用，在甲状腺癌组织和细胞中呈高表达。沉默survivin表达，可通过上调cleaved caspase 3蛋白的表达和下调Bcl-2蛋白的表达诱导甲状腺癌细胞凋亡。此结果为survivin在甲状腺癌中的作用机制及以survivin为甲状腺癌基因治疗的新靶点提供依据。