免疫治疗相关蛋白PD-1/PD-L1在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义

陶海云，屈中玉，吴艳林，蔡政

1南阳市中心医院肿瘤科，河南 南阳 473000

2云南省中医医院肿瘤科，云南 昆明 6500210

乳腺癌是女性较常见的恶性肿瘤之一，其中三阴性乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0%～20.8%[1]。三阴性乳腺癌是指肿瘤组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progestogen receptor，PR）和原癌基因人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均为阴性的乳腺癌[2]。三阴性乳腺癌具有特殊的生物学行为和临床特征，预后较其他类型乳腺癌差[3]，因此，寻找新的治疗策略，以提高三阴性乳腺癌患者的疗效及改善预后至关重要。程序性死亡受体1（programmed cell death l，PDCD1，也称PD-1）及程序性死亡受体配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）是近年来出现的一种新型免疫疗法[4]，主要通过阻断PD-1/PD-L1信号通路诱导肿瘤细胞凋亡以达到治疗目的[5]。相关研究表明，PD-1/PD-L1靶向治疗对晚期恶性黑色素瘤具有良好的预后结果[6]，因此本研究对PD-1/PD-L1在三阴性乳腺癌中的表达情况及其临床意义进行探讨，以期为三阴性乳腺癌的临床治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月至2017年12月南阳市中心医院收治的39例三阴性乳腺癌患者的乳腺癌组织（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）存档石蜡标本。纳入标准：①经病理学检查确诊为原发性乳腺癌；②术前均未接受放化疗治疗；③临床资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤。选取同期于南阳市中心医院行手术切除的病理诊断为非三阴性乳腺癌的39例患者的乳腺癌组织（1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm）石蜡标本为对照。两组患者的年龄、绝经情况、肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移情况、肿瘤侵犯神经情况及脉管内癌栓情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。

表1 两组患者的基本临床特征

1.2 实验方法

采用免疫组织化学法检测三阴性乳腺癌组织和非三阴性乳腺癌组织中PD-1和PD-L1水平。具体方法：石蜡组织切片，经二甲苯、乙醇脱蜡和水化后，用柠檬酸盐修复液进行抗原修复，再经过氧化氢水溶液处理，分别加入兔抗人PD-L1（稀释比例1∶100）及PD-1抗体（过氧化氢水溶液1∶100）孵育，用新鲜配制的3，3-二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）溶液显色，再将切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，最后中性树脂封固，于400倍镜下观察细胞膜和（或）细胞质的染色情况。抗人PD-1单克隆抗体和兔抗人PD-L1单克隆抗体均购自Cell Signaling公司，DoubleStain免疫组织化学检测试剂盒购自Abcam公司，浓缩型DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 评价标准

PD-1和PD-L1染色阳性为细胞膜和（或）细胞质呈现清晰的棕黄色至棕褐色颗粒，细胞不着色或细胞着色率＜5%认为是阴性表达，细胞着色率≥5%认为是阳性表达，肿瘤细胞及肿瘤间质内任一项阳性均为阳性表达[7]。细胞着色率为400倍视野下着色细胞数与总细胞数比值，共计数3个视野，取平均值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软-件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1、PD-L1蛋白表达情况的比较

三阴性乳腺癌组织中PD-1蛋白的阳性表达率为28.21%（11/39），高于非三阴性乳腺癌组织的10.26%（4/39），差异有统计学意义（χ2=4.044，P=0.044）；三阴性乳腺癌组织中PD-L1蛋白的阳性表达率为41.03%（16/39），高于非三阴性乳腺癌组织的15.38%（6/39），差异有统计学意义（χ2=6.331，P=0.012）。

2.2 乳腺癌组织中PD-1、PD-L1蛋白表达情况与三阴性乳腺癌患者临床特征的关系

不同年龄、绝经情况、组织学分级、肿瘤直径、淋巴结转移情况、肿瘤侵犯神经情况、脉管内癌栓情况三阴性乳腺癌患者乳腺癌组织中PD-1、PD-L1蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征三阴性乳腺癌患者乳腺癌组织中PD-1、PD-L1蛋白的阳性表达情况

3 讨论

乳腺癌是女性较为常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年升高，且呈年轻化趋势，严重影响着女性的身心健康[8]。三阴性乳腺癌是一类具有特殊生物学行为和临床特征，且预后较其他类型差的难治性乳腺癌[9]。目前，临床对三阴性乳腺癌患者一般仅行常规化疗，这主要是因为现有的抗HER2治疗、内分泌治疗等对三阴性乳腺癌患者的治疗效果均较差[10]。但常规化疗的不良反应较大，部分耐受能力差的患者无法完成整个化疗周期，且化疗后又极易出现复发、转移[11]，故寻找新的有效的治疗策略对三阴性乳腺癌患者的治疗尤为重要。

PD-1属于免疫共刺激分子家族成员之一，主要表达于多种免疫细胞，如成熟的T细胞、B细胞、胸腺细胞、树突状细胞及单核细胞等[12]。PD-L1是PD-1的重要配体之一，广泛表达于多种淋巴组织及肿瘤组织[13]。相关研究表明，PD-1/PD-L1信号通路参与细胞凋亡及T/B细胞活化过程[14]；进一步研究发现，PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关[15]。PD-1与PD-L1结合可以抑制多种炎性因子的释放，抑制淋巴细胞的增殖与活化，削弱机体的免疫监视作用，从而促进肿瘤的复发和转移[16]。因此，靶向PD-1/PD-L1的肿瘤免疫疗法成为近年来出现的一种新型肿瘤治疗方法，该方法主要是通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡及破坏肿瘤免疫逃逸系统，从而达到肿瘤治疗的目的[17]。相关研究表明，PD-1/PD-L1靶向治疗对晚期恶性黑色素瘤具有良好的预后结果[18]。

本研究结果显示，三阴性乳腺癌组织中PD-1和PD-L1的阳性表达率均高于非三阴性乳腺癌组织（P＜0.05），这提示三阴性乳腺癌组织中PD-1和PD-L1呈一致性阳性表达，推测三阴性乳腺癌患者可能从靶定PD-1/PD-L1的免疫治疗中获益。本研究进一步分析了PD-1、PD-L1表达情况与三阴性乳腺癌患者临床特征的关系，结果显示：PD-1、PDL1阳性表达与三阴性乳腺癌患者的年龄、绝经情况、组织学分级、肿瘤直径、淋巴结转移情况、肿瘤侵犯神经情况及脉管内癌栓情况无关（P＞0.05），这与Brockhoff等[19]的研究结果一致。上述结果提示，PD-1和PD-L1的表达水平可能与三阴性乳腺癌患者的病情进展无关，但三阴性乳腺癌组织中PD-1和PD-L1的阳性表达率明显高于非三阴性乳腺癌，这提示PD-1和PD-L1有可能参与了三阴性乳腺癌的发生，检测PD-1和PD-L1的表达对早期诊断三阴性乳腺癌可能具有积极意义，同时，阻断PD-1和PD-L1信号通路可能成为三阴性乳腺癌潜在的治疗靶点。

综上所述，在三阴性乳腺癌中PD-1、PD-L1具有较高的阳性表达率，阻断PD-1/PD-L1信号通路可能成为三阴性乳腺癌潜在的治疗靶点，但本研究未发现PD-1、PD-L1阳性表达与乳腺癌患者的临床特征有关，这可能因为本研究纳入的样本量较少。因此，今后仍需进一步加大样本量，以研究PD-1和PD-L1在三阴性乳腺癌中的表达情况及其与乳腺癌患者临床特征的关系，为三阴性乳腺癌的临床诊治提供更可靠的参考依据。